[发明专利]奶牛早期妊娠的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域，具体的说，本发明涉及一种基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测试剂盒及检测方法。

背景技术

妊娠诊断是奶牛生产管理中的重要环节，对奶牛实施早期妊娠诊断可以尽早发现空怀牛并对其进行发情处理和再次人工授精，可缩短产犊间隔、减少空怀导致的经济损失。根据国内外专家估计，空怀导致每头乳牛每日约减奶8-15千克；最低少生产牛犊0.003头，每头每日饲料、能源、人力等方面的消耗约20-30元。因此，探索科学、准确、简便、快捷的奶牛早期妊娠诊断新技术显得尤为重要。

在生产中常见最常用的妊娠诊断方法是直肠触诊，技术比较成熟的繁殖员在配种后45-50d可做出准确诊断，经验丰富的繁殖员最早可以在人工授精后35d判断是否妊娠；通过测定牛奶或者血液中的孕酮含量也可以判断奶牛是否受孕，该方法在人工授精后21-24d进行检测；目前已经开始初步使用但是尚未广泛推广的牛妊娠相关蛋白(PAG)ELISA试剂盒能在妊娠后28d做出较为可靠的判断。由此可见，这些方法均只能在奶牛人工授精三周后做出准确诊断。最新的研究报道证实利用PAG ELISA试剂盒于人工授精后28d排查出来的空怀牛，与同样条件下在妊娠46d时利用直肠检查的方法排查出来的空怀牛相比，对其实施同期发情并再次配种后的妊娠率和空怀天数并没有提高(Sinedino L D,Lima F S,Bisinotto R S,et al.Effect of early or late resynchronization based on different methods of pregnancy diagnosis on reproductive performance of dairy cows[J].Journal of dairy science,2014,97(8):4932-41)。研究指出，如果人工授精后一个情期内(三周)能排查出空怀牛，即可对其进行快速的同期发情处理，在第21-23d进行复配，减少空怀天数，提高奶牛的繁殖效率(Lucy M C,McDougall S,Nation D P.The use of hormonal treatments to improve the reproductive performance of lactating dairy cows in feedlot or pasture-based management systems[J].Animal reproduction Science,2004,82-83:495-512)。因此，从某种程度上来讲，能否于奶牛人工授精后一个情期内判断奶牛妊娠或者空怀，是缩短奶牛产犊间隔和提高繁殖率的关键。

综上，需要能够实现快速、有效且准确检测奶牛早期妊娠的产品，以尽早发现空怀牛并对其进行发情处理和再次人工授精，缩短产犊间隔、减少空怀导致的经济损失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、准确地检测奶牛早期妊娠的荧光定量RT-PCR的方法，以较早时间判断出青年牛人工授精后是否妊娠。

牛早期胚胎发育的过程中，在授精后14-18d即母体妊娠识别阶段，孕体合成并分泌的干扰素-τ(IFN-τ)可作用于血液中白细胞，引起一系列干扰素刺激基因上调表达，因此，通过定量PCR技术检测白细胞中这些干扰素刺激基因的表达水平可以进行妊娠诊断。本发明通过荧光定量PCR技术检测奶牛人工授精后18d外周血白细胞中干扰素刺激基因的表达水平来进行妊娠诊断，实现在奶牛人工授精后一个情期内判别妊娠牛和空怀牛。为空怀牛的复配节约时间，从根本上提高奶牛的繁殖效率。

该荧光定量RT-PCR检测方法包括如下步骤(步骤示意如图1)：

(1)血液标本的收集

采集青年牛(14-16月龄的奶牛)发情后人工授精前0d和人工授精后18d的外周血1.5-2ml，抗凝，低温冷藏。

(2)标本RNA的提取

血液总RNA提取试剂盒提取标本中总RNA(标本采集后2h内完成)，之后利用NanoDrop 2000超微量分光光度计分析RNA样本浓度与纯度(OD_260/280＝1.9-2.1)，同时采用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，通过质检的样本分装后，于-80℃保存备用。

(3)逆转录反应

逆转录采用试剂盒进行，每个反应RNA用量为500ng，根据RNA的浓度计算得出每次反应所需的体积，按照试剂盒说明书进行。