[发明专利]高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用

说明书

本发明公开了一种高效产氢功能基因载体pETD‑SL，及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域。pETD‑SL基因载体为包含有[NiFe]氢酶基因的pETDuet‑1质粒。其构建是通过设计引物扩增[NiFe]氢酶基因片段的大亚基hupL和小亚基hupS基因，并把上述两个基因片段用限制性内切酶酶切并用DNA连接酶将其相继连接到还有对应连接末端的pETDuet‑1片段中，进行基因测序，验证基因的完整性。将pETD‑SL质粒转化到细菌中，在产氢培养基中培养此细菌生产氢气。pETD‑SL能够应用于不同细菌中，既能使不产氢的细菌产氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高，消耗同样的底物浓度能产生更快更多的氢气。也能够改良现有工业产氢的大肠杆菌。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用。

背景技术

随着石油等化石能源的消耗速度加快及其储备不断减少的情况下，急需发展新型能源，而氢能源作为一种既高效又清洁的能源而备受关注。氢能源即可通过化学方法得到，但因其成本高且可能导致的环境污染问题而备受争议，而生物产氢即能解决这个问题。生物产氢的微生物有很多，其中大肠杆菌产氢无论从成本还是从效率来看都是最佳选择之一。目前来看，野生的大肠杆菌不产氢或者产氢较少，无法满足人类对能源的需求，因此，基因工程或者代谢工程就需要应用于改造大肠杆菌使其产氢性能大量增加。现有的产氢大肠杆菌消耗底物多，但是产生的氢气比较少，效率还比较低，急需通过改造引入外源基因使其产氢效率大幅度提高，而不同的外源基因的产氢效率也有所差别。

发明内容

本发明的目的是提供一个高效产氢功能基因载体pETD-SL，及其构建方法。其能够应用于不同细菌中，既能使不产氢的细菌产氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明提供一种高效产氢功能基因载体pETD-SL，其为包含有沼泽红假单胞菌的[NiFe]氢酶基因中大亚基基因片段和小亚基基因片段的pETDuet-1质粒。

本发明还提供了高效产氢功能基因载体pETD-SL的构建方法，包括以下步骤：

(1)设计[NiFe]氢酶基因中大亚基hupL和小亚基hupS的引物，并扩增[NiFe]氢酶基因片段的大亚基hupL和小亚基hupS基因。

(2)回收[NiFe]氢酶的大亚基hupL和小亚基hupS的基因片段，进行测序验证扩增基因的完整性。

(3)外源基因的克隆主要借助PCR技术，通过查找沼泽红假单胞菌[NiFe]氢酶基因的同源序列，利用DNAman或Primer设计DNA引物，克隆沼泽红假单胞菌[NiFe]氢酶基因，且通过DNA测序验证了序列的完整性。

(4)根据pETDuet-1上的酶切点设计引物，PCR扩增大亚基hupL和小亚基hupS基因片段，其中，作为优选，所述大亚基酶切位点为BamH I，AscI；所述小亚基酶切位点为BgIII，Knp I。

(5)切割回收扩增好的带有限制性酶切点的大亚基和小亚基基因片段，并用克隆载体pMD19-T质粒分别将大、小亚基基因片段连接起来，得到含大亚基和小亚基基因片段的重组载体。

(5)将重组载体中小亚基和pETDuet-1质粒分别用限制性内切酶作双酶切反应，然后用DNA连接酶将酶切后的pETDuet-1片段与的酶切好的小亚基片段连接得到pETD-S质粒；其中，此步骤中所述限制性内切酶为酶BgI II，Knp I。

(6)将重组载体中大亚基和(5)中pETD-S质粒分别用限制性内切酶作双酶切反应，然后用DNA连接酶将酶切后的pETD-S片段与的酶切好的大亚基片段连接，得到含有大、小亚基片段的pETD-SL质粒；其中，此步骤中所述限制性内切酶为酶BamH I，AscI。