[发明专利]一种家蚕核型多角体病毒快速检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种家蚕核型多角体病毒快速检测试剂盒及检测方法，具体涉及一种环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术与核酸检测侧向层析试纸(nucleic acid detection lateral flow dipstick，LFD)相结合快速便捷的检测家蚕核型多角体病毒的检测试剂盒及其检测方法，属于病毒疫病诊断技术领域。

背景技术

家蚕是重要的经济昆虫，所产蚕丝是丝绸原料的主要来源，在人类经济生活与历史文化中均具有重要的地位。然而高发的蚕病直接影响蚕茧的产量及质量，制约了养蚕业的健康和持续发展。蚕病分传染性蚕病和非传染性蚕病，以传染性蚕病危害为重。常见的传染性蚕病主要是僵病、脓病、软化病等三种。这些病的共同特点是潜伏期长、发病快、来势猛、范围广、危害性大，一般会导致减产10～20%，严重时高达80～90%，甚至颗粒无收，给蚕农带来极大的损失。而家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NuclearPolyhedrosisVirus，BmNPV）病是养蚕生产上最常见的、危害最严重的一类蚕病，家蚕患此病的后期常流出脓汁，内含大量的多角体病毒，俗称脓病。

目前该病毒的检测方法有电镜法、PCR检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感毒样品；二是成本太高，不适合推广使用；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户采用。

环介导等温核酸扩增技术（LAMP）作为一种新型的核酸检测技术，主要针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶的作用下，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测目前一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。

侧向流层析试纸（lateral flow dipstick, LFD）是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，使得LAMP-LFD反应结果可以直接肉眼观察。LFD试纸上有质控带和检测带，两条带都显色表示阳性，只有质控带而检测带不显色表明检测结果为阴性。该方法具有安全、快捷、高效、高灵敏度且无高的实验条件要求，适合应用推广。目前，该技术在家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的检测中尚未见报道，因此本检测试剂盒的研发和应用，能够便于在养殖现场，快速地对家蚕病毒病进行抽检，以及蚕农能够自行针对疑似病症进行检测，有利于家蚕核型多角体病毒的预防和阻遏，降低蚕农的养殖成本和经济损失。

发明内容

本发明针对现有技术中的缺陷，目的是建立一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱侧向层析试纸来检测家蚕核型多角体病毒的检测方法，并提供一种用于以上目的的LAMP-LFD检测试剂盒。该试剂盒特异性强，敏感率高，而且操作简便快捷，适合家蚕核型多角体病毒病的筛查与预防。

本发明提供一种家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：BmNPV LAMP预反应液，该反应液包括：1.2-1.6mM 引物BmNPV-FIP和BmNPV-BIP，0.2-0.4mM 引物BmNPV-F3和BmNPV-B3，0.05-0.1μM 探针BmNPV-FITC-PROBE，20-40mM Tris-HCl (pH8.0～9.0)，10-15mM 氯化钾，15 -20mM 硫酸铵，8-10mM 硫酸镁，0.1-0.2% Triton X-100，0.6-0.8M 甜菜碱，1.2-1.4mM dNTP，6-8U Bst DNA 聚合酶大片段；

其中，引物BmNPV-FIP序列见SEQ ID NO:1，引物BmNPV-BIP序列见SEQ ID NO:2，引物BmNPV-F3序列见SEQ ID NO:3，引物BmNPV-B3序列见SEQ ID NO:4, 探针BmNPV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO:5。

本发明所述的引物是根据NCBI公布的BmNPV基因组序列（GenBank: L33180.1），由在

线软件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)设计和手工修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，由其中选出两对引物和一条探针：

引物BmNPV-F3（SEQ ID NO:1）: CCGGCAAACAGATCGTCAA

引物BmNPV-B3（SEQ ID NO:2）: CGTCCAGTACATGGTGGC