[发明专利]苯妥因均相酶免疫检测试剂盒及其多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体涉及苯妥因均相酶免疫检测试剂盒及其多克隆抗体的制备方法。

背景技术

癫痫是一种常见的神经系统疾病,也是我国神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大顽症。目前,抗癫痫类药物仍然是控制癫痫发作的主要手段。传统的抗癫痫类药物苯妥因（结构式如下）治疗窗窄、个体差异大、疗效和毒性反应与血药浓度密切相关,临床医生仅凭经验给药往往达不到有效血药浓度。因此，苯妥因血药浓度的监测对癫痫的诊断和治疗具有重要的临床指导意义。

  苯妥因

目前，国内外测定苯妥因血药浓度的方法主要是高效液相色谱（HPLC）、荧光偏振免疫分析（FPIA）、微粒酶免法、免疫比浊法、酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法。采用HPLC法，需要样本前处理，操作相对复杂、且检测成本昂贵；ELISA检测法灵敏度较高，但无法精确定量；荧光偏振免疫分析（FPIA）具有操作简单、灵敏度高等优点，但试剂成本高，不适合常规治疗药物的检测，阻碍个性化治疗的推广。

专利CN2012101255333公开了一种苯妥因均相酶检测试剂盒用的抗苯妥因特异性抗体，其通过对苯妥因中苯环对位进行取代后与免疫原偶联而获得的，其苯妥因免疫原结构式如下：

美国专利US5306617及US5747352也公开了类似的苯妥因均相酶检测试剂盒用的抗苯妥因特异性抗体，其利用与苯妥因咪唑啉环上的一个氨基偶联的免疫原而获得的，其苯妥因免疫原结构式如下：

但是通过上述衍生方法制备的抗体不能够充分体现其整体免疫性，从而影响苯妥因均相酶检测试剂盒的灵敏度及特异性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种苯妥因免疫原，其通过苯妥因衍生物与载体偶联获得，其结构式如式I所示：

式I

式中，R为连接基团，载体为具有免疫原性的蛋白质。

R选自如下基团：-(CH₂)_n-COO-、-O-(CH₂)_n-COO-、-S-(CH₂)_n-COO- 或-O-(CH₂)_n-NH-COO- 等，n是1至20之间的整数。

在本发明更进一步地实施方案中， R优选为-O-CH₂-NH-COO-。载体优选为血清蛋白，血蓝蛋白或甲状腺球蛋白；更优选为牛血清蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种抗苯妥因特异性多克隆抗体，其由所述苯妥因免疫原免疫宿主动物后生产而得到的。

所述抗苯妥因特异性多克隆抗体的制备方法为：

步骤a：

苯妥因衍生物的活化：将苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入纯二甲基酰胺、无水乙醇、10 mM pH为 5.0 的磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

步骤b：抗原的偶联和纯化：将牛血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白溶解于10mL0.2 M pH为 8.5的磷酸缓冲液中得到溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12 -16小时，得到偶联的苯妥因抗原，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；

步骤c：采用步骤b得到的苯妥因免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体。

优选的所述步骤a为：

苯妥因衍生物的活化：将20 mg特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入700 μL 纯二甲基酰胺、700 μL无水乙醇、1.4 mL 10 mM pH为 5.0 的磷酸钾缓冲液、80 mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和10 mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

步骤b：抗原的偶联和纯化：将40 mg牛血清白蛋白溶解于10 mL0.2 M pH8.5的磷酸缓冲液中得到牛血清白蛋白溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12 -16小时，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；