[发明专利]一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种6-O季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备，属于生物医药技术领域。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)是一类重要的超氧阴离子自由基清除剂，可用于防治过量超氧阴离子自由基引起的疾病和机体损伤，如辐射损伤、缺血再关注损伤、自身免疫性疾病等。目前超氧化物歧化酶的主要来源为从动植物中提取，存在抗原性、体内半衰期短和稳定性差等缺点，限制了其应用。对其分子进行化学修饰是克服超氧化物歧化酶上述缺点的有效方法，常采用的修饰剂有聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、低分子肝素、壳聚糖等，修饰后的SOD免疫原性降低、体内半衰期延长、稳定性增加。

壳聚糖是目前发现的自然界存在的唯一一种阳离子多糖，具有清除自由基，抗炎等作用，季铵化能改善其水溶性并进一步提高其带正电荷的能力。Liu JF等(参见Journal of drug targeting,2009.17(3):216-224.)采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)缩合法使N,N,N-三甲基季铵化壳聚糖(TMC)的自由氨基与SOD分子的羧基形成酰胺键得修饰产物，研究表明TMC修饰的SOD衍生物具有稳定性高、体内半衰期长和显著的细胞靶向性等优点，是一种有研究和开发价值的SOD衍生物。

TMC制备过程中，壳聚糖的2-NH₂被甲基化后首先生成2-NH(CH₃)甚至2-N(CH₃)₂，然后才能进一步形成2-N(CH₃)₃⁺季铵基团，因此，水溶性良好的TMC中的自由氨基数量极少(一般<10％)，导致其对SOD的效率较低、结合物活性保持率差，制约了季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的进一步研究和应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶(O-HTCC-SOD)修饰物，并提供该修饰物的制备方法。

术语说明

自由氨基：伯胺基团(即—NH₂)，亦称一级胺基。

6-O-季铵化壳聚糖：壳聚糖的C₆-OH上接枝一个含有季铵盐的基团而得到的衍生物。本申请中采用2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)接枝到壳聚糖C₆-OH上得到O-(羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖(O-HTCC)衍生物，水溶性良好，自由氨基率在70％以上。

本发明的技术方案如下：

一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物，由超氧化物歧化酶(SOD)分子上的羧基与季铵化壳聚糖(O-HTCC)分子的氨基通过酰胺键结合，结构式如下：

(SOD)n-CO-NH-O-HTCC；

式中，n＝1～10；SOD的分子量为32000Da；O-HTCC的分子量为2000Da以上，自由氨基摩尔含量为不小于20％。

优选的，所述n＝1～6，即一分子O-HTCC与1～6分子SOD共价结合形成修饰物；O-HTCC的分子量为5000Da～100000Da，自由氨基摩尔含量为不小于50％。

一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将超氧化物歧化酶溶于10mM pH 6.0的PBS缓冲液，制得超氧化物歧化酶溶液，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为1∶(1～200)，超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1～100)，反应20～40min，制得反应液A；

(2)取6-O-季铵化壳聚糖(O-HTCC)溶于10mM pH 6.0的PBS缓冲液，制得季铵化壳聚糖溶液，然后加入步骤(1)制得的反应液A，使超氧化物歧化酶与6-O-季铵化壳聚糖的质量比为1：(0.1～50)，反应5～7h，经分离纯化，制得6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的超氧化物歧化酶溶液中超氧化物歧化酶的浓度为0.5～5mg/ml；超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为1∶(50～150)，超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(10～50)。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，反应条件为室温条件下100～600r/min搅拌反应25～35min；所述步骤(2)中，反应条件为室温条件下100～600r/min搅拌反应5～7h。