[发明专利]一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备

权利要求书

1.一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物，由超氧化物歧化酶分子上的羧基与季铵化壳聚糖分子的氨基通过酰胺键结合，结构式如下：

(SOD)n-CO-NH-O-HTCC；

式中，n＝1～10；SOD的分子量为32000Da；O-HTCC的分子量为2000Da以上，自由氨基摩尔含量为不小于20％。

2.如权利要求1所述的6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物，其特征在于，所述n＝1～6；O-HTCC的分子量为5000Da～100000Da，自由氨基摩尔含量为不小于50％。

3.一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将超氧化物歧化酶溶于10mM pH 6.0的PBS缓冲液，制得超氧化物歧化酶溶液，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为1∶(1～200)，超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1～100)，反应20～40min，制得反应液A；

(2)取6-O-季铵化壳聚糖溶于10mM pH 6.0的PBS缓冲液，制得季铵化壳聚糖溶液，然后加入步骤(1)制得的反应液A，使超氧化物歧化酶与6-O-季铵化壳聚糖的质量比为1：(0.1～50)，反应5～7h，经分离纯化，制得6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的超氧化物歧化酶溶液中超氧化物歧化酶的浓度为0.5～5mg/ml；超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为1∶(50～150)，超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(10～50)。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，反应条件为室温条件下100～600r/min搅拌反应25～35min；所述步骤(2)中，反应条件为室温条件下100～600r/min搅拌反应5～7h。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的6-O-季铵化壳聚糖的制备方法如下：

①取3g壳聚糖溶于100ml质量浓度为10％的醋酸水溶液中，40℃搅拌30min，充分溶胀，加入苯甲醛15.8g，继续搅拌反应1h，制得乳白色反应液，于60℃真空干燥12h，调节pH至中性，过滤，收集沉淀，用甲醇洗涤，烘干，制得反应物A；

②将步骤①制得的反应物A研磨后，置于圆底烧瓶中，加入50ml异丙醇，搅拌30min后，逐滴加入9g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，70℃水浴回流搅拌16h，反应液过滤，得到的固体用甲醇洗涤，真空干燥，制得反应物B；

③将步骤②制得的反应物B研磨后，置于圆底烧瓶中，加50ml 0.25mol/L的盐酸乙醇溶液，室温下搅拌反应24h，蒸发去除大部分溶剂，再加入15ml水，溶解后，加入过量丙酮，沉淀过夜，经离心，收集沉淀，干燥，制得O-HTCC粗品，然后溶于水中，采用滤膜截留分子量为10kD超滤仪超滤去除小分子杂质，超滤截留液经冷冻干燥，制得O-HTCC。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤①中，pH调节剂为质量浓度为10％的NaOH溶液；所述步骤③中，超滤仪为Millipore Labscale超滤仪。

8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的6-O季铵化壳聚糖溶液中季铵化壳聚糖的浓度为1～5mg/ml；优选的，所述步骤(2)中的超氧化物歧化酶与6-O季铵化壳聚糖质量比为1：(0.5～10)。

9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的分离纯化为采用DEAE弱阴离子交换柱层析纯化。

10.一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将超氧化物歧化酶50mg溶于50ml浓度为10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得超氧化物歧化酶溶液；再加入50mg EDC和10mg NHS，温室下震荡反应30min，制得反应液A；

(2)称取6-O-季铵化壳聚糖50mg溶于25ml浓度为10mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，制得6-O-季铵化壳聚糖溶液，然后加入步骤(1)制得的反应液A，震荡反应6h，经2.6×40cm的DEAE Sepharose Fast Flow树脂进行分离纯化，用pH 8.0、浓度10mmol/L～100mmol/L磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速1.5ml/min，检测波长254nm，收集各洗脱组分，制得6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。