[发明专利]一种用于丝状真菌Crispr-Cas系统的Cas9编码基因及其应用

说明书

本发明提供了用于丝状真菌Crispr‑Cas系统的Cas9编码基因及其应用。具体地，本发明涉及一种适合于丝状真菌异源表达Cas9编码基因的密码子优化方案以及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及利用密码子优化Cas9基因构建CRISPR/Cas的基因组编辑方法。本发明的密码子优化方案，能有效的提高Cas9基因在丝状真菌的表达量，能成功的应用于CRISPR/Cas的基因组编辑方法，给丝状真菌的分子改造带来极大的便利。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种Cas9编码基因密码子优化方案，及其在丝状真菌Cripr-Cas基因组编辑系统中的应用。

背景技术

基因组编辑技术是进行功能基因组研究的一类重要工具，它们可以让研究人员能够在多种物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平的精确度，精准而高效。锌指核酸酶技术(ZFNs)、类转录激活因子核酸酶技术(TALENs)以及CRISPR/Cas技术是近年来发展起来的3种主流基因组编辑技术。

上述3种基因组编辑技术的原理都是通过在生物基因组特定位点制造DNA断裂损伤,从而激活机体自身的DNA损伤修复机制，在此过程中引发各种变异。ZFNs是最早发展的通用基因组编辑技术,可用以实施定点敲除和定点敲入变异，但ZFNs技术的发展受限于构建难度大、成本高等缺点。TALENs技术在ZFNs基础上发展而来，较ZFNs技术而言,TALENs技术具备构建灵活度高、成本低等优势.不同于ZFNs与TALENs技术，CRISPR/Cas技术具有独特的DNA靶向机制,，这种机制使其非常适合进行多位点编辑。

目前，CRISPR/Cas系统已在多种物种中测试成功,例如小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫和家蚕。但是本领域中仍然缺乏适用于丝状真菌的Crispr-Cas系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于丝状真菌Crispr-Cas系统的Cas9编码基因及其应用。

本发明提供了包括密码子优化的Cas9基因的表达载体和宿主细胞，以及利用密码子优化的Cas9基因构建CRISPR/Cas基因组编辑的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:1的第4-4116位所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与(a)中多核苷酸的同源性≥95％(较佳地≥98％)并且编码Cas9蛋白的多核苷酸；

(c)与(a)-(b)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的互补为完全互补。

本发明的第二方面，提供了一种表达载体，它含有本发明第一方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述表达载体为组成型表达载体或诱导型表达载体。

在另一优选例中，所述组成型表达载体中的组成型启动子选自下组：Ppdc、Ppki、Ptef1和Pgpda等启动子。

在另一优选例中，所述诱导型表达载体中的诱导型启动子选自下组：Pcbh1、Pcbh2、Peg1和Pxyn2等启动子。

在另一优选例中，所述表达载体具有选自下组的质粒骨架：pDHt/sk质粒、pMD-18T、pXBthg、pAN52等。

本发明的第三方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第二方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第一方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为真菌细胞，较佳地为丝状真菌细胞。