[发明专利]一种用于丝状真菌Crispr-Cas系统的Cas9编码基因及其应用

权利要求书

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，多核苷酸选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:1的第4-4116位所示的多核苷酸；

(c)与(a)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

2.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1中所述的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为组成型表达载体或诱导型表达载体。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述组成型表达载体中的组成型启动子选自下组：Ppdc、Ppki、Ptef1和Pgpda启动子。

5.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述诱导型表达载体中的诱导型启动子选自下组：Pcbh1、Pcbh2、Peg1和Pxyn2启动子。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求2所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求1所述的多核苷酸。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真菌细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为丝状真菌细胞。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述丝状真菌包括但不限于：里氏木霉(Trichoderma reesei)、曲霉菌(Aspergillus sp.)、脉孢霉(Neurospora sp.)。

10.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的基因组中插入有编码异源蛋白的多核苷酸序列。

11.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述异源蛋白的多核苷酸序列通过CRISPR/Cas系统插入所述宿主细胞的基因组中。

12.一种基于CRISPR/CAS技术的真菌系统，其特征在于，所述的系统包括

(i)真菌细胞，所述真菌细胞表达外源的Cas9蛋白；和

(ii)用于CRISPR/CAS技术的gRNA；或用于产生所述gRNA的表达载体，所述的真菌细胞中，编码所述Cas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

13.如权利要求12所述的真菌系统，其特征在于，所述的Cas9蛋白为Streptococcuspyogenes的Cas9。

14.如权利要求12所述的真菌系统，其特征在于，所述的真菌细胞为丝状真菌细胞。

15.一种基因组编辑方法，其特征在于，所述方法包括步骤：利用CRISPR/Cas技术对权利要求6中所述宿主细胞进行基因组编辑。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述基因组编辑包括但不限于：基因突变、基因敲除、基因插入、大片段敲除或者多拷贝表达。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述基因组编辑方法包括步骤：

(a)培养权利要求6所述的宿主细胞；

(b)利用CRISPR/Cas技术，在所述宿主细胞中的待编辑的基因组位点进行基因组编辑，从而形成基因组发生编辑的宿主细胞；

(c)利用筛选标记，从培养物中分离出所述的基因组发生编辑的宿主细胞。