[发明专利]一种凝血酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生化制药领域，涉及一种凝血酶的制备方法，具体涉及一种有效降低杂质和去除/灭活病毒、效价稳定的凝血酶的制备方法。

背景技术

凝血酶是一种广泛存在于人体和动物血液中的丝氨酸蛋白酶，它是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，显现出促凝和抗凝的特性。当循环凝血因子在暴露的血管外组织与组织因子相接触时，凝血酶会在组织上聚集。凝血酶通过激活血小板催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血块稳定，从而在血栓性疾病的引发和发展中发挥核心作用。由于凝血酶能直接作用于血液中的纤维蛋白原，促使其转变为纤维蛋白、加速血液的凝固而止血，因此临床上将其用于外伤、手术、口腔、耳鼻咽喉、泌尿、妇产科、消化道出血的止血，特别是用于手术中不易结扎的小血管止血、消化道出血及外伤出血等。

目前，临床上应用的凝血酶主要是由人血以及猪、牛等动物血分离提取的。其中，由于猪血来源充分，原料成本低等因素，所以大量凝血酶产品都是由猪血制备的，少量的是由人血及牛血等血液制备的。但是，不论是从动物血还是从人血制备的凝血酶产品，现有的制备方法都会存在以下几个问题：(1)凝血酶产品效价不稳定；(2)产品杂质及杂蛋白浓度偏高；(3)存在引入各种病毒的风险，这些都会限制凝血酶产品的临床应用，并造成安全隐患。

中国发明专利申请CN1031160486(以下简称在先专利)公开了一种猪凝血酶的制备方法，该方法包括以下步骤：一、分离猪血浆；二、化学法病毒灭活；三、吸附凝血酶原；四、收集凝血酶原；五、纳米过滤；六、凝血酶原的活化；七、凝血酶的冻干保存。该专利申请并未公开用于病毒灭活的试剂和纳米膜的种类，而且所述方法得到的产品杂质含量偏高，其产品的效价也有待进一步提高。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种凝血酶的制备方法，该制备方法在进一步提高凝血酶产品的效价的基础上，更有效地去除了凝血酶产品中的杂质并使病毒充分灭活后被除去。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一种凝血酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)过滤除去猪血浆中的杂质；

(2)向步骤(1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，进行病毒灭活处理；

(3)向步骤(2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，吸附凝血酶原，抽滤；

(4)以包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤(3)得到的吸附凝血酶原的吸附剂；

(5)将步骤(4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中，抽滤；

(6)将步骤(5)得到的滤液置于2.94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析；

(7)将步骤(6)得到的经透析的溶液加热至33-36℃，加入体积比为7％的溶液A，再加入体积比为7％的溶液B和体积比为7％的溶液C，搅拌后静置；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液并经加热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤(6)得到的经透析的溶液加入体积比为7％的溶液A并搅拌后，加入体积比为7％的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液；

(8)将步骤(7)得到的溶液的pH调节至5.2-5.6，静置后离心，将上清液的pH调节至6.0-6.5，静置；

(9)将步骤(8)得到的上清液通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液；

(10)将步骤(9)得到的洗脱液经超滤膜过滤；

(11)将步骤(10)得到的滤液经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病毒；

(12)将步骤(11)得到溶液制成制剂。

在上述制备方法的步骤(1)中，所述猪血浆为经过抗凝预处理的猪血浆；优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入抗凝剂，静置后离心，收集上层血浆；更优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入体积比为1/9的抗凝剂，轻轻搅匀，在0-10℃下静置后，并于5-8小时内离心，离心温度为8-15℃，离心时间为15-20分钟，收集上层血浆；优选地，所述抗凝剂为38克/升的柠檬酸三钠水溶液；进一步优选地，所述经过抗凝预处理的猪血浆在0-10℃下保存0-6小时或者-18℃以下冰冻贮存二年以内备用；优选地，所述过滤为分别经70目、100目、200目滤网过滤。