[发明专利]一种凝血酶的制备方法

权利要求书

1.一种凝血酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)过滤除去猪血浆中的杂质；

(2)向步骤(1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，进行病毒灭活处理；

(3)向步骤(2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，吸附凝血酶原，抽滤；

(4)以包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤(3)得到的吸附凝血酶原的吸附剂；

(5)将步骤(4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中，抽滤；

(6)将步骤(5)得到的滤液置于2.94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析；

(7)将步骤(6)得到的经透析的溶液加热至33-36℃，加入体积比为7％的溶液A，再加入体积比为7％的溶液B和体积比为7％的溶液C，搅拌后静置；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液并经加热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤(6)得到的经透析的溶液加入体积比为7％的溶液A并搅拌后，加入体积比为7％的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液；

(8)将步骤(7)得到的溶液的pH调节至5.2-5.6，静置后离心，将上清液的pH调节至6.0-6.5，静置；

(9)将步骤(8)得到的上清液通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液。

(10)将步骤(9)得到的洗脱液经超滤膜过滤；

(11)将步骤(10)得到的滤液经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病毒；

(12)将步骤(11)得到溶液制成制剂。

2.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(1)中，所述猪血浆为经过抗凝预处理的猪血浆；优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入抗凝剂，静置后离心，收集上层血浆；更优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入体积比为1/9的抗凝剂，轻轻搅匀，在0-10℃下静置后，并于5-8小时内离心，离心温度为8-15℃，离心时间为15-20分钟，收集上层血浆；优选地，所述抗凝剂为38克/升的柠檬酸三钠水溶液；进一步优选地，所述经过抗凝预处理的猪血浆在0-10℃下保存0-6小时或者-18℃以下冰冻贮存二年以内备用；优选地，所述过滤为分别经70目、100目、200目滤网过滤。

3.根据权利要求1或2所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(2)中，优选地，所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和体积比浓度为1％的Triton X-100的水溶液。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在上述制备方法的步骤(3)中，优选地，所述吸附剂为DEAE-Sephadex A-50型离子交换树脂；优选地，所述吸附剂与血浆的质量比为0.5～2.5：1000，优选为1.5：1000。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(4)中，优选地，所述洗涤用溶液与血浆的比为100毫升～200毫升：1000克，更优选为160毫升：1000克。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(5)中，优选地，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫升～60毫升：1000克，更优选为35毫升：1000克。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(6)中，优选地，所述透析用溶液与血浆的比为2500毫升～3500毫升：1000克，更优选为3000毫升：1000克。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(8)中，优选地，采用1摩尔/升冰醋酸水溶液将pH调节至5.2-5.6；优选地，采用饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至6.0-6.5。