[发明专利]一种血管化生命结构体一站式制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型血管化生命结构体的制备方法，属于组织工程支架的制备领域。

背景技术

生命结构体是由组织工程支架、细胞、生长因子等构成。关键技术包括结构构建、功能实现和细胞组装等方面。

近年来，以3D打印技术为核心的生物制造，为快速直接地构建生命结构体的宏观几何形状提供了技术基础。但是，在功能性的构建方面还存在诸多问题无法解决。例如血管化功能，其对于组织内细胞的营养供给、气体交换、代谢物排出、生长因子传递有着极其重要的意义。目前在组织工程与临床医学领域主要是通过生长因子、细胞共培养、富血供环境植入或者机械应力刺激等手段，改变细胞生存的物理化学环境，达到“促”血管化的作用。而这些促血管化策略相对地缺乏对于最终血管网络几何构造的可控性，也难以实现大体积内部的快速血管化，进而造成移植的失败。从制造的角度，一种解决思路是将单纯供细胞生长的支架发展为具有类血管网络的支架，即利用先进制造技术在具有生物相容性的材料中创建具有血管样的三维网络微通道。

另外，对于生命结构体至关重要的细胞组装，目前的技术主要为激光技术和挤压/喷射技术，但是这些方法均无法解决细胞在微结构内部的定位问题。尤其是在多细胞共培养中，要求指定细胞达到指定位置的问题。针对此问题，本发明利用细胞迁移效应来解决。细胞迁移指的是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。当环境中存在梯度变化的化学或物理信号时,细胞膜和细胞骨架会发生极化,细胞的两端呈现差异。在外部梯度信号的作用下,持续地朝同一个方向发生极化,细胞会发生连续的迁移。

发明内容

本发明的目的在于针对已有技术存在的缺陷，提供一种血管化生命结构体的一站式制备方法，定位于生命结构体的集成制造，实现细胞、结构材料、生长因子等多尺度对象的同时加工，从而大大降低传统生物制造的复杂程度。为了实现上述目的，本发明的构思如下：

设计出一种独特的3D打印同轴喷头，以创建同轴流体环境。该组件包括：内针头（1-1）、三通（1-2）、外针头（1-3）、四氟乙烯管（1-4），等等，如图1。其特征在于：内、外针头通过三通形成同轴结构；内针头大端与三通锥面相接并胶粘固定，外针头与三通过盈连接；内外针头的同轴度通过各自与三通的内外圆柱面的配合来保障；四氟乙烯管套于外针头上。

中空纤维作为血管化生命结构体的基本单元，其制备原理如图2：生物材料原液与交联剂原液在注射泵（1）的推动下分别通入同轴喷头（4）的外针头（1-3）和内针头（1-1），并在四氟乙烯管（1-4）管腔的约束下形成同轴射流。随着两流体的接触，外层的环形生物材料原液沿径向方向由内向外被交联，并沿轴向流动方向由最初的粘流态逐渐趋于完全凝胶化，形成中空纤维。

微观细胞组装方法，其特征在于使得中空纤维所装载多细胞呈血管微观结构类似的规则的细胞分布，如图3。首先，多细胞均匀分布在生物材料原液中被挤出，而生长因子随交联剂在中空纤维芯部流动；随后，生长因子沿纤维径向扩散形成一定的浓度梯度，在该梯度的诱导下细胞随即发生定向迁移；最终，多细胞体系实现区域化单一细胞富集。

基于以上中空纤维制备方法和微观细胞组装方法，并使之与3D打印技术集成，从而实现血管化生命结构体一站式制备。按照上述发明构思，本发明采用下述技术方案：

一种血管化生命结构体的一站式制备方法，其特征在于：如图4，制备系统由注射泵（1）提供材料挤出所需推动力；采用两个医用活塞式注射器作为两个供料针筒（2、3），一个为芯层供料针筒（3），另一个为壳层供料针筒（2）；同轴喷头（4）的内针头连接芯层供料针筒（3），同轴喷头（4）的侧面通道连接壳层供料针筒（2）；制备工艺流程如图5：

1）原液制备：将生物材料及其交联剂以相应的溶剂按设定比例分别配制成生物材料原液和交联剂原液；

2）细胞与生长因子混入：按设定浓度将单一细胞或多细胞添加至生物材料原液，充分混合均匀后作为壳层材料装入壳层供料针筒（2）；按设定浓度将生长因子添加至交联剂原液，充分混合均匀后作为芯层材料装入芯层供料针筒（3）；

3）中空纤维制备：生物材料原液与交联剂原液在同轴喷头（4）内形成同轴流体，所形成的环形生物材料原液被芯部的交联剂原液交联固化，出离同轴喷头（4）后即形成管状的中空纤维（5）； 

4）微观细胞组装：芯层交联剂溶液中的生长因子向中空纤维（5）中扩散，并沿其径向呈梯度分布；纤维壳层中所装载的细胞在生长因子梯度作用下迁移而呈规则的分区域组装；