[发明专利]一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体，属于酶工程领域。 

背景技术

L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH₃。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，对骨髓细胞没有抑制作用。 

L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。 

一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有易培养，成本低等优点，成为学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、Erwinia chrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。 

L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichiacoli、Erwinia chrysanthemi、B.subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。 

本发明通过定点突变改变蛋白质分子内部的疏水性，从而进一步提高天冬酰胺酶酶活。 

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种酶活力提高的天冬酰胺酶突变体，所述突变是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的来源于枯草芽孢杆菌的天冬酰胺酶蛋白质内部氨基酸进行定点突变，从而提高了天冬酰胺酶的活性。 

所述突变是将天冬酰胺酶第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸，得到突变体N133Y、N133W；或将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸，得到突变体V143I；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为色氨酸或酪氨酸，得到 突变体N133W/V143I、N133Y/V143I。 

天冬酰胺酶突变体N133Y、N133W、V143I、N133W/V143I、N133Y/V143I的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2-6所示。 

本发明解决的另一个技术问题是提供构建所述突变体的方法，是通过定点突变技术将天冬酰胺酶蛋白质分子内部第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸；或将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸。 

在本发明的一种实施方式中，将含有编码天冬酰胺酶的基因与载体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E.coli rosetta。挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％。菌体长到OD₆₀₀为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h。收集发酵上清，纯化获得天冬酰胺酶突变体。 

本发明还提供一株天冬酰胺酶分泌能力增强的大肠杆菌，是将含有编码天冬酰胺酶的基因与表达载体连接后转化大肠杆菌。 

在本发明的一种实施方式中，将含有编码天冬酰胺酶的基因与载体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E.colirosetta。 

本发明还提供一种提高天冬酰胺酶活力的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬酰胺酶蛋白质分子内部第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸；或将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸。