[发明专利]一种犬干扰素α融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有抗病毒活性的犬干扰素α融合蛋白及其核酸序列及其制备方法和应用。

背景技术

干扰素(interferon，INF)是最早发现的细胞因子，因其具有干扰病毒的感染和复制功能而得名。其中，干扰素α因其广谱的生物学功能而被广泛应用和研究。1986年，美国国家食品和药品管理局(FDA)批准重组α干扰素治疗人毛细胞白血病，此后，重组INFα又被批准治疗艾滋病患者发生的Kaposi’s肉瘤、慢性髓样白血病、滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、丙型肝炎、乙型肝炎等疾病[金伯泉，医学免疫学[M].第5版.北京：人民卫生出版社，2008：61.]。犬是人类忠实的朋友。根据犬的用途，可分为宠物犬和实用犬，实用型的犬有实验犬、导盲犬、警犬等。无论哪一种，均是人类生活和工作上的好伙伴。但是随着饲养量的增加，犬病，特别是病毒病的发病率不断升高，常常导致犬的死亡，给人类造成精神和经济上的损失。犬的3大烈性病毒病，包括狂犬病、犬细小病毒病和犬温热病，致死率均非常高[王红.犬α干扰素的表达及其治疗犬病毒性肠炎临床疗效观察[D].北京：中国农业科学院，2009.]。犬干扰素α由于其抗病毒活性而在治疗犬的病毒病方面有很大的前景。

传统的生产干扰素α的方法是用人工方法在动物机体外或体内，在干扰素诱生剂诱导下产生干扰素α。由于动物产生的干扰素α很微量[王红，犬α干扰素的表达及其治疗犬病毒性肠炎临床疗效观察[D].北京：中国农业科学院，2009.]，传统方法产生的干扰素α无法满足需求。随着分子生物学的发展，基因工程表达干扰素α成为可能。从1987年Adolf Himmler第一个克隆出犬干扰素α的基因[Adolf Himmler，Rudolf Hauptmann，etc.Structure and expression in Escherichia coli of Canine Interferon-αgene[J].Journal of interferon research，1987，7：173-183.]后，国内外陆续有关于基因工程克隆表达犬干扰素α的研究报道[Taira，O，etc.Cloning and expression of Canine interferon-αgenes in Escherichia coli[J].Immunology，2005，67(10)：1059-1062.项黎丽等，犬α干扰素的克隆、表达及纯化[J].中国动物检疫，2010，1：35-38.]。

但干扰素α在大肠杆菌中多以包涵体形式存在，几乎无活性，需要经过变性复性的过程来获得具有活性的蛋白质[李桂伟.犬α干扰素的基因工程研究进展[J].黑龙江水产，2012，1：38-39]。复性过程时间长，需要大量的化学试剂，提高了成本。并且犬干扰素α中含有多个二硫键，增加了复性成功的困难。所以不需要复性的可溶的蛋白是降低工业成本的关键。

现有技术中，为提高外源蛋白在大肠杆菌系统中表达的可溶性，通常采用基因工程技术将目标蛋白与一些分子伴侣蛋白相融合。该方法在提高外源蛋白可溶性的同时往往还能提高融合蛋白在大肠杆菌中的表达量。但是融合蛋白通常需要表达后再酶切才能释放出有活性的蛋白。而酶切的步骤增加了纯化工艺和成本，酶消化过程则增加了蛋白质的不稳定性。因此本发明提出的基因工程表达的犬干扰素α不需要酶切将极大地节约生产的成本。另外，现在市场上的干扰素制剂需要每天给药，2-4周为一个疗程。每天给药和长时间的周期不仅是病犬的痛苦，也增加了饲养主的精神和经济负担。本发明通过基因工程将犬干扰素α与大肠杆菌蛋白NusA蛋白融合表达，NusA蛋白分子量大，能够保护分子量较小的犬干扰素α，形成空间位阻，阻止蛋白酶对犬干扰素α的降解，使犬干扰素α稳定性提高，能长时间保留活性，本发明对犬干扰素α稳定性的提高有效地改善了上述现状。

发明内容

现有技术中的犬干扰素α在大肠杆菌表达系统中多为包涵体。本发明克服了现有技术制备犬干扰素α产物为包涵体的缺陷，提出了一种可溶的犬干扰素α融合蛋白及其核酸序列。针对现有技术中的犬干扰素α多为包涵体、表达量低、融合蛋白虽能解决上述缺陷但往往需要表达后再酶切才能释放出有活性的犬干扰素α的问题，本发明提出了一种犬干扰素α融合蛋白，不但不用酶切就有活性，且稳定性提高。

本发明提出一种编码犬干扰素α融合蛋白的核酸序列，所述犬干扰素α融合蛋白具有如SEQ ID No：1所示的核酸序列。