[发明专利]一组核苷酸序列及在单增李斯特菌鉴定中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及交叉恒温扩增在细菌检测中的应用，特别是在单增李斯特菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。 

背景技术

单增李斯特菌(Listeria monocytogens，LM)是广泛存在于环境中的革兰氏阳性、有运动能力、兼性胞内寄生短杆菌，是重要的食源性人兽共患病原菌，能够引起人类严重感染。李斯特菌病的易感人群主要为免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生儿和孕妇；后者为肿瘤患者、艾滋病患者和器官移植受体等。人类李斯特菌病主要临床症状为败血症、脑膜炎、孕妇流产、死产以及发热性胃肠炎等，该菌可穿越肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障。单增李斯特菌病在人类的感染率不高，但该病的死亡率极高而受到广泛的关注，一度成为欧美国家重大公共卫生问题。国内尚无由单增李斯特菌引起食物中毒暴发的报道，实际存在与否不明，散发病例在多个省市都有报道。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗和单增李斯特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的单增李斯特菌检测方法成为必要。 

目前对于单增李斯特菌分离鉴定主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法耗时大约5到7天，包括二次增菌，选择培养及后续的生化鉴定，耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于单增李斯特菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，较高的探针合成费用，以及熟练的操作人员。一些基层实验室无法开展，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断单增李斯特菌的PCR方法和real-time PCR方法，所选择的目的基因(如hly，prfA，iap) 特异性差，极易出现假阳性扩增。此外PCR检测技术的灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。随着恒温技术的出现，环介导恒温扩增技术(LAMP)已经被用于单增李斯特菌的检测，然而该技术的引物设计复杂，对目的基因的保守性要求较高，目前报道的诊断单增李斯特菌的LAMP技术主要根据hly和prfA基因设计引物，然而这些基因的特异性差，容易导致假阳性扩增，不利于单增李斯特菌的准确诊断。因而，急需发展一种简单、快速、灵敏和特异的诊断技术用于单增李斯特菌检测。 

交叉恒温扩增技术(Cross priming amplification,CPA)是由Xu Gaolian等建立的一种新的恒温核酸扩增技术，具有灵敏高、操作简单、不依赖于昂贵设备、产物易检测等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领域。CPA针对靶序列的5个特异部位设计7条引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，靶序列能够得以高效扩增。7条核心引物之中2条为交叉引物，即As和Sa；2条为置换引物，即4s和5a；3条为扩增引物，即3a、2a和1s。交叉引物As包含2a和1s，即5'-2a-1s；Sa包含1s和2a，即5'-1s-2a。