[发明专利]在受体细胞的目的基因组序列引入变异的系统和方法

说明书

技术领域

本发明基于分子遗传领域，具体说，是利用瞬时表达和反转录系统在受体细胞基因组序列中引入特定变异。

背景技术

遗传修饰技术为在由活体细胞或组织的基因组核糖核酸序列编码的遗传信息中引入变异提供了可能。传统的基因改造技术涉及将一段外源核酸序列整合到受体基因组的随机位点。这些方法是基于将含有外源序列的载体引入受体细胞，外源DNA随机整合到受体基因组，并分离含有外源序列的细胞。这些遗传信息在受体基因组的非自然整合有一些局限性。外源序列的随机整合，整合位点可能在组织存活必须的基因内，而扰乱其功能。就算外源基因的插入没有损坏宿主基因，外源基因的表达也会受到周围基因DNA的影响(位点效应)。在某些情形下，周围基因组环境的负面影响如此之大，以至于外源基因无法表达。在另一些情形下，周围基因组环境可能导致外源基因的过渡表达从而损害受体细胞。外源基因的多位点整合有时会导致RNA干扰(RNAi)。这些方法的另一个问题是在受体基因组中加入不必要或无用的遗传物质，例如病毒或其他载体残余，调控序列和标记基因。这些无用遗传物质可能在长时期内对受体组织产生不可知的影响，并且标记基因，比如抗除草剂基因和抗抗生素基因对健康和环境的可能的影响，值得担忧。

为解决这些传统基因改造技术的问题，发展了在宿主基因组特定位点上引入变异的靶向基因改造技术。这些技术是通过特异位点校正或定点突变修饰游离体或染色体中的目标序列。其中一些技术利用不同类型的寡聚或多聚核苷酸，如：双链DNA(dsDNA)，单链DNA(ssDNA)，含有5’和/或3’端修饰以抵御细胞内核酸酶降解的寡聚核苷酸(Campbell et al.,1989)，杂合RNA/DNA或DNA/DNA分子(Igoucheva et al.,2004a；Parekh-Olmedo et al.,2005)，RNA寡聚核苷酸(Storici,2008)，和三合寡聚核苷酸(Simon et al.,2008)。Campbell及其同事用单链核酸成功地在由共同转化的质粒编码的卡那霉素磷酸转移酶基因中诱导了一个变异。Zorin及其同事将一段外源单链DNA插入到蓝藻(Chlamydomonas reinhardti)基因组的特定位点并报道单链DNA非同源重组的几率明显小于双链DNA(Zorin et al.,2005)。Kmeic及其同事研发了利用杂合RNA/DNA二元寡聚核苷酸在高等真核细胞目的基因的特定位点诱导变异，并报道杂合RNA/DNA二元引物的变异转化率高于未修饰的单链寡聚核苷酸(美国专利，专利号5,565,350)。同源基因改造的分子机制并不完全清楚。一种可能的机制是变异诱导序列与目的基因序列杂交，从而产生触发DNA修复机制的错配泡，DNA修复机制利用变异诱导序列为模板“纠正”受体细胞目的基因组序列。其他机制可能涉及链入侵(strand invasion)或同源重组。

基于寡聚核苷酸的靶向修饰技术的一个主要缺陷是成功率低，部分原因可以归咎于外源寡聚/多聚核苷酸的降解和有限供应(Zorin et al.,2005)。Kmeic et al.描述了一个利用经过抗核酸酶修饰的单链寡聚核苷酸进行靶向修饰的技术。经抗核酸酶修饰如硫代磷酸酯键(phosphorothioate linkage)，LNA键，和2-O-甲基修饰的寡聚核苷酸和未经修饰的单链寡聚核苷酸相比，胞内降解度低，诱变成功率高。经优化修饰的单链寡聚核苷酸的诱变成功率可比RNA/DNA二元杂合引物高2-3倍(美国专利，专利号6,936,497)。但化学修饰对参与变异诱导的酶的影响并不十分清楚。尽管经过优化修饰，在多数情况下，变异诱导率仍然相对较低，大约在1x 10^-4左右(Zhu，2000)。靶向基因改造的另一个问题是来自外源DNA非同源整合的竞争。同源整合和非同源整合的比率随不同组织和细胞类型而变化。例如酵母同源整合和几率相对较高，而高等真核生物如植物和动物的非同源整合频率显著高于同源整合。Zorin et al.发现单链(ssDNA)和双链(dsDNA)DNA同源重组的效率相似，但单链DNA(ssDNA)相对于双链DNA(dsDNA)，非同源重组的倾向性要小得多(Zorin,2005)，这项发明为减少非同源整合提供了一个简单的解决方法。