[发明专利]在受体细胞的目的基因组序列引入变异的系统和方法

权利要求书

1.一种在受体细胞的目的基因组序列引入变异的系统，所述系统包括：

a)一个基因组DNA诱变序列GSMS表达盒，其中所述的GSMS表达盒包括一段和所述目的基因组序列同源的多聚核苷酸序列和一个引物结合序列，其中所述的GSMS表达盒产生GSMS RNAs；

b)一个反转录酶表达盒，其中所述的反转录酶表达盒包括一段编码反转录酶的多聚核苷酸序列，所编码的反转录酶可以是天然的或工程改造的反转录酶，并且所述反转录酶可以是有较好的校对功能或较差的校对功能；以及

所述GSMS表达盒与反转录酶表达盒通过同一表达载体或不同表达载体导入到受体细胞中，在受体细胞中，所述GSMS RNAs被所述反转录酶反转录为ssGSMS cDNAs，并且所述ssGSMS cDNAs在所述目的基因组序列导致变异。

2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述的GSMS包括一段与所述目的基因组序列完全互补的序列在被引入到受体细胞中后所述GSMS可与受体细胞基因组序列配对杂交；或者，除在所述GSMS预先设定的位置有一个或几个核苷酸的区别外，所述的GSMS包括一段与所述目的基因组序列完全互补的序列，所述的核苷酸的区别是错配、删除、插入或以上所列的组合。

3.根据权利要求1所述的系统，其中，所述GSMS包括一段非同源多聚核苷酸序列，夹在与受体细胞基因组序列同源的序列间；优选的，所述的非同源多聚核苷酸序列编码一个选择标记基因。

4.根据权利要求1所述的系统，其中所述的GSMS包括一段与目的基因组序列的同源重组热点区域同源的序列，或者，所述的GSMS包括一段与含有正向和反向重复的目的基因组序列同源的序列。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的系统，其中所述GSMS的引物结合序列与天然或人工tRNA序列的3’端互补。

6.根据权利要求5所述的系统，其中GSMS RNA的5’端可以形成二级结构，当所述反转录酶遇到所述二级结构时终止反转录。

7.根据权利要求6所述的系统，还包括一个引物表达盒，其中所述的引物表达盒产生天然的或人工的引物tRNA，引物tRNA与所述GSMS RNAs上的所述引物结合序列结合，起始反转录。

8.根据权利要求1-4、6或7所述的系统，还包括

ssDNA结合蛋白表达盒，其中所述的ssDNA结合蛋白表达盒编码一个ssDNA结合蛋白；

其中，所述的ssDNA结合蛋白包括：RecA、RecA的同源蛋白、Rad51、Rad51的同源蛋白、DMC1、DMC1的同源蛋白、ICP8、ICP8的同源蛋白、SSB和SSB的同源蛋白。

9.根据权利要求1-4、6-8中任意一项所述的系统，还包括

一个靶向核酸内切酶表达盒，所述靶向核酸内切酶表达盒编码一个靶向核酸内切酶，而且所述靶向核酸内切酶包括一个DNA序列识别结构域和一个DNA核酸内切酶结构域，并且所述靶向核酸内切酶和所述GSMS指向所述目的基因组序列的同一同源区域；

其中，所述的靶向核酸内切酶的所述DNA序列识别结构域选自这样一组蛋白，这组蛋白包括，锌指蛋白DNA序列识别结构域，转录激活因子样效应因子DNA序列识别结构域，和大型核酸酶的序列识别结构域。

10.根据权利要求9所述的系统，其中所述靶向核酸内切酶的所述DNA核酸内切酶结构域能够切割一段双链多聚核苷酸序列产生双链断裂，或者，只切割双链DNA中的一条链从而在双链DNA上造成一个缺口。

11.根据权利要求1-4和6-10中任意一项所述的系统，还包括一个siRNA表达盒，其中所述的siRNA表达盒产生siRNA引发所述目的基因组序列的mRNA的降解，并且siRNA与所述GSMS RNAs没有同源序列。