[发明专利]一种明日叶查尔酮合成酶基因的序列

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种植物基因工程领域的基因序列，具体涉及一种明日叶类黄酮化合物合成关键基因的查尔酮合成酶基因的DNA、cDNA开放阅读框全长序列及编码蛋白的氨基酸序列。

背景技术

明日叶，伞形科当归属草本植物，原产自日本八丈岛，因岛民多食用明日叶，均较长寿，因此明日叶又名长寿菜。明日叶具有抗癌、防止细胞老化、提高机体免疫力、抗血栓、降血压等保健功能，被誉为“21世纪的健康食品”。研究发现，明日叶富含一种特有成分查尔酮，属黄酮类化合物，而此黄酮类化合物具有很高的药用价值(药食兼用植物明日叶的研究进展及应用刘畅,王正武等，食品与药品2013,15(3)205-209)(周先丽,梁成钦,徐庆,等.明日叶的化学成分[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(3):103-105)，孟扬等在关于查尔酮抑制小鼠癌细胞的研究中证明了查尔酮的药用功能(孟扬,钟进义,孙赫.明日叶查尔酮对小鼠肝癌细胞Caspase-3和Bax蛋白表达的影响[J].癌变.畸变.突变,2011,23(1):50-53)。因此明日叶的药用及保健功能与其富含查尔酮有着必然联系。黄酮类化合物是一类重要的植物次生代谢物质，指基本母核为苯基色原酮类化合物，现在则泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的一系列化合物。黄酮类化合物合成途径中，主要是由多个结构基因和调节基因来完成的，通过苯丙氨酸代谢途径，从苯丙氨酸经过三步酶促反应生成香豆酰辅酶A，再在查尔酮合成酶的作用下，与丙二酸辅酶A缩合生成查尔酮，然后在查尔酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)和异黄酮合酶(IFS)等催化下合成黄酮、异类黄酮、花青素类等化合物(蒋明,曹家树.查尔酮合成酶基因[J].细胞生物学杂志,2007,29(4):525-529)。因此，查尔酮合成酶(CHS)在苯丙氨酸代谢途径中扮演着极其重要的角色，是类黄酮合成途径中的关键酶和限速酶。因此明日叶查尔酮合成酶基因CHS可应用于明日叶类黄酮化合物合成的调控。目前，国内外关于查尔酮合成酶的报道较多，主要集中在十字花科的拟南芥、禾本科的稻、玉米、豆科的大豆、苜蓿、豌豆、葡萄科的葡萄、菊科植物等，但未曾见任何公开报道伞形科当归属明日叶查尔酮合成酶基因的克隆及DNA、cDNA开放阅读框全长序列和编码蛋白的氨基酸序列，同时对于UV-C照射处理对明日叶CHS基因表达的影响和查尔酮含量调控研究也未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种明日叶查尔酮合成酶基因DNA全序列、开放阅读框ORF序列以及该基因编码的氨基酸序列，并且在获得高查尔酮含量明日叶品种中得到应用，为调控明日叶黄酮类化合物合成及在转基因植物中的应用提供有效的技术手段。

本发明的技术方案是：

一种明日叶查尔酮合成酶基因的序列，其具有SEQ ID NO.1中从第1-1413位所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO.2中从第1-1194位所示的核苷酸序列。

进一步地，所述的序列编码的多肽具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

本发明的另一技术方案是：

一种所述的明日叶查尔酮合成酶基因在获得高查尔酮含量明日叶品种中的应用。

本发明所述的明日叶查尔酮合成酶基因CHS全长的克隆，依次通过以下步骤实现：

1)根据菊科植物查尔酮合成酶基因保守序列设计兼并引物，以明日叶叶片cDNA为模板，扩增明日叶查尔酮合成酶基因的保守区域；

2)基于获得的明日叶查尔酮合成酶基因的保守区域设计基因特异引物，进行3’、5’race克隆，分别得到明日叶CHS基因的3’、5’端序列，通过拼接得到明日叶CHS基因的ORF序列，并命名为Ak-CHS；

3)根据明日叶CHS基因ORF设计基因全长引物，以明日叶cDNA为模板进行PCR扩增，验证获得的CHS基因ORF全长序列，并以DNA为模板，以上述设计全长特异引物进行PCR扩增获得基因DNA全长。

4)根据获得的ORF序列设计Ak-CHS荧光定量引物，以actin为内参基因设计其荧光定量引物，通过UV-C照射处理明日叶叶片不同时间，以不同时间提取的明日叶叶片RNA反转录的cDNA为模板进行q-PCR，并测定不同时间明日叶叶片查尔酮提取量。

本发明具有如下的有益效果：