[发明专利]嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和细胞生物学领域，涉及一种嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒及其制备方法和应用。 

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)急性感染后易慢性化和发展成为肝硬化、肝细胞肿瘤或肝功能衰竭。一直以来丙型肝炎的疫苗研制受到高度变异、缺乏细胞和小动物模型等多种原因的限制而进展缓慢。HCV病毒中许多蛋白抗原(如核心蛋白、包膜蛋白和非结构蛋白)都可诱导抗体产生。但在这些抗体中，只有针对包膜糖蛋白E1/E2的中和抗体具有保护作用。近年来研究发现，HCV包膜糖蛋白E1/E2存在保守的中和性抗原表位，针对这些表位的单克隆抗体具有广谱的交叉中和活性。以上研究结果使为中和表位疫苗的研究提供了依据。寻求理想的载体，呈递和表达中和抗原表位，成为HCV中和表位疫苗研究的方法之一。 

病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)是不含病毒颗粒，形态结构与天然病毒颗粒相似的能自我装配的病毒空壳。许多病毒结构蛋白都具有自主组装成VLPs的能力。由于VLPs不含病毒遗传物质，所以不具备感染性，而具有很强的免疫原性和生物学活性，广泛应用于疫苗研究领域。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合体VLPs并将外源性抗原展示在其表面，保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，比亚单位疫苗和重组的蛋白疫苗具有更强的免疫原性，能够激发机体体液免疫、细胞免疫及粘膜免疫。 

HBV小包膜蛋白抗原(HBsAg-S)基因大小为681bp，在无核心蛋白和基因组参与下有自我装配能力。其101～159位氨基酸区域为亲水区，形成的双环结构可表达外源性表位蛋白，在哺乳动物细胞中形成与野生型病毒相似 的VLPs，可分泌至细胞外。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒及其制备方法和应用，该病毒样颗粒表面展示不同的HCV中和抗原表位，嵌合病毒样颗粒免疫小鼠后可产生HCV中和表位特异性的中和抗体。该方法将HCV中和抗原表位嵌合于HBV S抗原亲水区，不影响其自我包装，从而形成嵌合的病毒样颗粒，表达HCV中和抗原表位。 

本发明是通过以下技术方案来实现： 

嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒，该病毒样颗粒是将HCV表位插入HBV S抗原亲水区构建真核表达载体，再经哺乳动物细胞体外装配制得；其中，所述的HCV表位为氨基酸序列如SEQ.ID.NO：1～4中任意一项所示的表位肽。 

氨基酸序列如SEQ.ID.NO：1～3所示的表位为高度保守的中和表位；氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示的表位为高变区的模拟表位。 

氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的表位为HCV E1区线性中和表位；氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示的表位为HCV E2区线性中和表位；所述高变区的模拟表位为HCV E2模拟表位。 

嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒的制备方法， 

包括以下步骤： 

1)在HBV S基因亲水区引入Age I克隆位点 

将引入Age I克隆位点的全长S基因亚克隆至真核表达载体pCI-neo中，得到重组真核表达载体pCI-HBS； 

2)将HCV表位以引物合成的形式克隆入重组真核表达载体pCI-HBS中 

以pCI-HBS为模板，分别用FE1Age I/R2Xba I，FE2Age I/R2Xba I，FE3Age I/R2Xba I，FE4Age I/R2Xba I为引物，扩增得到引入不同表位的 HBV S下游128-227位氨基酸的碱基序列，扩增产物回收后连接入T-easy载体，分别得到T-HBSE1，T-HBSE2，T-HBSE3，T-HBSE4； 

3)构建嵌合HCV中和抗原表位真核载体 

将T-HBSE1，T-HBSE2，T-HBSE3，T-HBSE4分别用Age I/Xba I双酶切，克隆入Age I/Xba I双酶切的pCI-HBS中，得到重组的嵌合HCV中和抗原表位的真核表达载体，分别为pCI-HBSE1，pCI-HBSE2，pCI-HBSE3，pCI-HBSE4； 

4)病毒样颗粒的制备