[发明专利]一种检测小麦中毒死蜱的化学发光酶联免疫分析法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶联免疫检测试剂盒，尤其涉及一种检测小麦中毒死蜱的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

近些年来，科学家不断发现一些来源于环境中的化学物质能够模拟内分泌激素功能从而引起生物体内分泌系统紊乱，称其为环境激素或环境荷尔蒙。环境激素已成为继臭氧层、地球气候变暖之后全球的第三大环境问题，成为环境科学研究领域中的热门课题。美国环境保护局给出的环境激素的定义，是指一类干扰体内与生物体的正常行为及与生殖、发育相关的正常激素的合成、贮存、分泌、体内运输、结合及清除等过程的外源性化合物。

环境激素是环境中的激素类似物，它能通过与激素受体结合，干扰生物体正常的生理代谢、内分泌和生殖机能，引起种种负面的生物学效应。环境激素通过环境介质和食物链进入人体或动物体内，干扰其内分泌系统和生殖功能系统，影响后代的生存和繁衍。因此安全问题受到高度重视。国标中规定小麦中最大残留限量为0.5mg/kg。

目前，检测毒死蜱的方法主要有：放射免疫法，高效液相色谱法(HPLC)、色/质联用分析法(LC-MS)、液/质联用分析法(LC-MS/MS)。薄层色谱法的缺陷是：操作过程复杂，时间长；操作人员需要经过专业培训；影响分析的干扰因素较多，结果重复性差。放射免疫法，高效液相色谱法、色/质连用分析法、液/质联用分析法这些理化方法的缺陷是仪器设备昂贵，样品前处理复杂，费时，费力，不易普及，检测费用高，特别是放射免疫法还需要配备放射源，有一定危险性。鉴于此，建立一种有效、快速、简单、灵敏的检测小麦中毒死蜱的方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种毒死蜱的化学发光酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点。

本发明所述毒死蜱的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的毒死蜱系列标准溶液、酶标羊抗兔抗体、毒死蜱抗体、发光溶液、洗涤溶液、包被溶液及封闭溶液；其特征在于：

所述酶标板的各孔包被有以毒死蜱与卵清蛋白偶合制成的包被抗原，其中包被抗原浓度优选10μg/mL。

所述卵清蛋白的分子量范围优选6.7KDa~6.8KDa。

所述毒死蜱系列标准溶液分别是0mg/kg，0.1mg/kg，0.3mg/kg，0.9mg/kg，2.7mg/kg和8.1mg/kg所述酶标羊抗兔抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，其工作浓度优选为1:1000。

所述毒死蜱抗体是由毒死蜱与分子量范围是6.7KDa~6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的多克隆抗体，其工作浓度优选为1:1000。

所述发光液是0.01M鲁米诺与0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH＝8.8)和3/10000(体积比)H₂O₂的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。

所述洗涤溶液是含有体积分数0.05％吐温-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠的溶液，pH为9.5。

所述封闭溶液是每升洗涤溶液中含10g卵清蛋白(OVA，ovalbumin，也称鸡卵清白蛋白或鸡卵白蛋白，由386aa组成，分子量约43Kd)且加入重量分数0.5％NaN₃的溶液。

本发明试剂盒最大检测范围为0.1mg/kg~8.1mg/kg。

本发明试剂盒中涉及的毒死蜱标准溶液、酶标羊抗兔抗体溶液、毒死蜱抗体溶液、发光溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：

1、毒死蜱标准溶液：以常规方法配制浓度分别为0mg/kg，0.1mg/kg，0.3mg/kg，0.9mg/kg，2.7mg/kg和8.1mg/kg的毒死蜱标准溶液；

2、酶标羊抗兔抗体溶液：酶标羊抗兔抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，使用时用洗涤溶液配制成1:1000的工作浓度；

3、毒死蜱抗体溶液：毒死蜱抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的多克隆抗体，将所得毒死蜱抗体用洗涤溶液稀释成1:1000的工作浓度；

4、发光溶液：是0.01M鲁米诺与0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH＝8.8)和3/10000(体积比)H₂O₂的混合液；