[发明专利]一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法，属于微生物发酵领域。

背景技术

高密度培养(HCDC)即高密度发酵，一般指微生物在液体培养基细胞群体密度超过常规培养的10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌，尤其是E.coli工程菌的高密度培养。与传统的培养相比，高密度培养具有诸多优势，主要体现在：(1)较高的生物量；(2)反应体系所需空间减小，投资成本降低；(3)生产周期变短与成本降低；(4)更加有利于目标产物的分离纯化。尽管高密度培养与传统培养相比具有上述诸多优势，但是随着菌体培养密度的增加也会带来一些问题，如：(1)菌体培养密度的上升使得发酵液黏度增加，培养物中溶氧不足；(2)呼吸作用的增强导致CO₂及热量的积聚；(3)代谢产物对细胞生长的限制性问题；(4)底物浓度对细胞生长可能存在的限制或抑制问题；(5)生产过程中产物的不稳定性问题；(6)培养过程中一些副产物如乙酸的积累等；

在进行高密度培养的实践过程中，为了避免上述问题的影响，通常会采用适当的流加补料策略来进行控制。补料策略可根据补料方式的不同分为两类：反馈式补料和非反馈式补料。

反馈补料策略能够在线及时的反应发酵体系中各参数的变化情况，但是微生物生长过程中极其复杂的细胞与外界环境及细胞之间的交互作用，培养过程中参数的随时变化，这就对在线检测设备提出了具有高精度、高灵敏度、高可靠性的要求，这无疑限制了反馈补料策略在大规模工业化生产中的应用。相对于反馈补料策略而言，非反馈补料策略中绝大都数的过程参数都是离线测定的，这就避免在线检测对的设备的要求，并且下一阶段的补料可根据上一阶段的测定结果来调节，这就不仅强化了补料的灵活性，而且还有利于收获更高的目标产物。在非反馈补料策略中，最常用的就是指数流加，通过指数流加可以控制细胞的比生长速率，从而达到有效控制发酵体系中有害产物乙酸的累积。

本发明提供了一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的培养基及其应用方法，提高了菌体密度、蛋白表大量。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种重组大肠杆菌高密度发酵产脯氨酸氨肽酶的培养基，利用该培养基能有效地获得较高密度菌体量。

所述发酵培养基，按g·L^-1计，含有葡萄糖5-7.5；鱼粉蛋白胨17.5-22.5；酵母浸膏27.5-32.5；K₂HPO₄12.04-13.04；KH₂PO₄1.81-2.81；灭菌后添加Mg²⁺至终浓度5.0-7.5mmol·L^-1，pH7.0-7.4。

所述发酵培养基中的葡萄糖需要单独灭菌后与其他成分混合。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基按g·L^-1计，含有葡萄糖5-6，鱼粉蛋白胨18-20，酵母浸膏28-30，K₂HPO₄12.04-12.54，KH₂PO₄2-2.31，灭菌后添加Mg²⁺至终浓度5.0-7.5mmol·L^-1，pH7.0-7.2。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有(g·L^-1)：葡萄糖，5；鱼粉蛋白胨，20；酵母浸膏，30；K₂HPO₄，12.54；KH₂PO₄，2.31；灭菌后添加Mg²⁺至终浓度7.5mmol·L^-1。pH7.2。

所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌为宿主，表达了来源于米曲霉的脯氨酸氨肽酶。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌为宿主，以pET-28a(+)为载体，编码脯氨酸氨肽酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述发酵培养基高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法。