[发明专利]一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌高密度发酵产脯氨酸氨肽酶的培养基，其特征在于，按g·L^-1计，含有葡萄糖5-7.5，鱼粉蛋白胨17.5-22.5，酵母浸膏27.5-32.5，K₂HPO₄12.04-13.04，KH₂PO₄1.81-2.81，Mg²⁺5.0-7.5mmol·L^-1，pH7.0-7.4。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基按g·L^-1计，含有葡萄糖5-6，鱼粉蛋白胨18-20，酵母浸膏28-30，K₂HPO₄12.04-12.54，KH₂PO₄2-2.31，灭菌后添加Mg²⁺至终浓度5.0-7.5mmol·L^-1，pH7.0-7.2。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基按g·L^-1计，含有葡萄糖5，鱼粉蛋白胨20，酵母浸膏30，K₂HPO₄12.54，KH₂PO₄2.31，灭菌后添加Mg²⁺至终浓度7.5mmol·L^-1，pH7.2。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述Mg²⁺是MgSO₄的Mg²⁺。

5.一种应用权利要求1所述培养基高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法，是将对数期种子以1％～5％的接种量，转接到装液量57-71％的发酵罐中，通气量和溶氧分别维持在3～5vvm和28-32％，罐压为常压，搅拌转速为500-1200rpm，发酵温度为36～37℃；当葡萄糖耗尽、溶氧开始回升，进行补料培养，补料时控制菌体的比生长速率为0.15-0.2h^-1，补料过程中偶联溶氧与转速，控制溶氧在28-32％左右；当接种培养至18-22h，添加2.75～3.25g/L的乳糖进行诱导产酶，酶活力下降时放罐。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌为宿主，以pET-28a(+)为载体，表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码脯氨酸氨肽酶的基因。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将对数期种子以2％的接种量，转接到装液量60％的发酵罐中，通气量和溶氧分别维持在3vvm和30％，罐压为常压，搅拌转速为500rpm，发酵温度为37℃；当葡萄糖耗尽、溶氧开始回升，进行补料培养，补料时控制菌体的比生长速率为0.2h^-1，补料过程中偶联溶氧与转速，控制溶氧在30％；当接种培养至20h，添加3g/L的乳糖进行诱导产酶，酶活力下降时放罐。

8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述补料培养采用的补料培养基含有400-500g·L^-1葡萄糖、2.5-3g·L^-1MgSO₄。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述补料培养采用的补料培养基含有500g·L^-1葡萄糖、3g·L^-1MgSO₄。