[发明专利]兔白介素 1 β重组蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种白介素重组蛋白，尤其涉及一种兔白介素1β重组蛋白，属于分子生物领域。 

背景技术

白细胞介素-1(IL-1)，是一种主要由单核细胞、巨噬细胞合成分泌的蛋白质多肽。人的IL-1相对分子量为15KDa～17KDa，根据其分子结构和等电点的差异，可将其分为两个分子亚型(IL-l alpha、IL-1 beta)，这两个亚型之间氨基酸序列有很大差别，但他们可识别同一个受体IL-1R。 

IL-1具有广泛的免疫调节作用:促进胸腺细胞、T细胞的活化增殖和分化；诱导单核细胞和巨噬细胞产生IL-6和TNF alpha；协同IL-4等细胞因子刺激B细胞的增殖和分化；通过提高NK细胞对IL-2等细胞因子的敏感性增强其杀伤活性；促进IL-2、IL-3、IL-4等多种免疫分子基因的表达。白介素1β还具有影响消化吸收等功能。 

目前国内对动物细胞因子的研究较少，兔白介素1β尚无人研究，缺乏重组蛋白产品。兔子是常用的实验动物之一，具有重要的医学价值；由于其重要的临床医学价值，白介素1β已成为研究热点之一。重组蛋白经常以包涵体形式表达，不能以可溶性蛋白形式存在，从而降低了其应用价值，而复性技术是亟待解决的技术难题。 

发明内容

本专利根据已发表的兔白介素1 beta(1β)基因序列，设计针对兔白介素1β基因的特异引物，通过PCR扩增和基因重组技术，经原核系统表达获得了兔白介素1β重组蛋白，采用亲和吸附柱纯化技术获得了生物纯兔白介素1β重组蛋白，由于该重组蛋白以包涵体形式表达，本发明发明出蛋白复性技术将包涵体还原为可溶性蛋白。该兔白介素1β重组蛋白可以用于相关研究也可作为标准品用于ELISA等酶联免疫分析和疾病诊断，也可应用于抗体的制备。 

本发明首先公开了一种制备兔白介素1β重组蛋白的方法，包括以下步骤： 

1)引物设计：设计并合成扩增兔白介素1β的引物，引物序列如SEQ ID NO：2-3所示； 

2)PCR扩增：以含有SEQ ID NO：1所示基因序列的DNA为模板进行扩增，PCR扩增程序为：95℃预变性15min；94℃45s，58℃45s，72℃60s，共30个循环；最后72℃延续10min，获得扩增产物； 

3)重组质粒的构建：采用内切酶酶切前述扩增产物后连接到同一内切酶酶切的原核表达载体pET32a质粒上，连接产物转化感受态细胞DH5α，筛选重组质粒并测序； 

4)蛋白的诱导表达：测序正确的重组质粒命名为pET32a-rabbit IL-1β，转化感受态细胞BL21，IPTG诱导重组蛋白表达； 

5)蛋白纯化：菌体裂解后收集包涵体，镍柱纯化后经蛋白复性，获得纯化的兔白介素1β重组蛋白。 

优选的，步骤5)所述蛋白纯化具体包括以下步骤： 

A.包涵体处理：采用裂解液裂解菌体后离心弃上清，采用Buffer B1溶解沉淀并离心，上清含有兔白介素1β包涵体蛋白用于下一步的分离纯化； 

B.分离纯化：分离纯化采用镍柱亲和层析，层析介质为Ni-NTA，以20ml灭菌水清洗Ni-NTA预装柱，然后用10ml Buffer B2平衡Ni-NTA预装柱后上样；再用10ml Buffer B2和20ml Wash Buffer清洗Ni-NTA预装柱；最后用10ml Buffer E洗脱Ni-NTA预装柱，收集洗脱液，获得纯化的兔白介素1β包涵体蛋白； 

C.蛋白复性：将兔白介素1β包涵体蛋白稀释到浓度在0.1μg/μl以下，经TGE缓冲液透析，浓缩，收集获得复性后的兔白介素1β蛋白。 

更优的，步骤A所述裂解液的配方为：50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑、0.5mM PMSF,pH 8.0；所述Buffer B1的配方为：100mM NaH₂PO₄、10mM Tris、6M盐酸胍，pH8.0。