[发明专利]兔白介素 1 β重组蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种制备兔白介素1β重组蛋白的方法，包括以下步骤：

1)引物设计：设计并合成扩增兔白介素1β的引物，引物序列如SEQ ID NO：2-3所示；

2)PCR扩增：以含有SEQ ID NO：1所示基因序列的DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增程序为：95℃预变性15min；94℃45s，58℃45s，72℃60s，共30个循环；最后72℃延续10min，获得扩增产物；

3)重组质粒的构建：采用内切酶酶切前述扩增产物后连接到同一内切酶酶切的原核表达载体pET32a质粒上，连接产物转化感受态细胞DH5α，筛选重组质粒并测序；

4)蛋白的诱导表达：测序正确的重组质粒命名为pET32a-rabbit IL-1β，转化感受态细胞BL21，IPTG诱导重组蛋白表达；

5)蛋白纯化：菌体裂解后收集包涵体，镍柱纯化后经蛋白复性，获得纯化的兔白介素1β重组蛋白。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述蛋白纯化具体包括以下步骤：

A.包涵体处理：采用裂解液裂解菌体后离心弃上清，采用Buffer B1溶解沉淀并离心，上清含有兔白介素1β包涵体蛋白用于下一步的分离纯化；

B.分离纯化：分离纯化采用镍柱亲和层析，层析介质为Ni-NTA，以20ml灭菌水清洗Ni-NTA预装柱，然后用10ml Buffer B2平衡Ni-NTA预装柱后上样；再用10ml Buffer B2和20ml Wash Buffer清洗Ni-NTA预装柱；最后用10ml Buffer E洗脱Ni-NTA预装柱，收集洗脱液，获得纯化的兔白介素1β包涵体蛋白；

C.蛋白复性：将兔白介素1β包涵体蛋白稀释到浓度在0.1μg/μl以下，经TGE缓冲液透析，浓缩，收集获得复性后的兔白介素1β蛋白。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤A所述裂解液的配方为：50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑、0.5mM PMSF,pH8.0；所述Buffer B1的配方为：100mM NaH₂PO₄、10mM Tris、6M盐酸胍，pH8.0。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤B所述Buffer B2的配方为：100mM NaH₂PO₄、10mM Tris、8M尿素，pH8.0；所述Wash Buffer的配方为：100mM NaH₂PO₄、10mM Tris、20mM咪唑、8M尿素，pH8.0；所述Buffer E的配方为：100mM NaH₂PO₄、10mM Tris、250mM咪唑、8M尿素，pH8.0。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤C所述TGE缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.5mM EDTA、5％甘油、1％甘氨酸、10mMβ-巯基乙醇、0.5mM PMSF,pH8.0。

6.一种用于扩增兔白介素1β的引物序列，包括上游引物F1和下游引物F2，上游引物F1的序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物F2的序列如SEQ ID NO：3所示。

7.如权利要求6所述的引物序列，其特征在于，所述引物扩增的模板为含SEQ ID NO：1所示序列的质粒或基因片段。

8.如权利要求7所述的引物序列，其特征在于，所述引物扩增的模板为pUC57-rabbit IL-1β质粒。

9.权利要求1-5任一权利要求所述制备方法以及权利要求6-8任一权利要求所述引物在兔白介素1β重组蛋白生产中的应用。