[发明专利]用于检测和测定连翘苷的抗体、方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及小分子半抗原的抗体及其制备方法与应用，特别是涉及连翘苷及其衍生物的抗体及其制备方法与应用。

背景技术

本发明涉及用于检测和定量连翘苷的方法和试剂盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、偶联物(conjugate)和抗体。

其中“检测”是指定性分析物质是否存在。

其中“测定”是指对物质进行定量分析。

连翘苷，来源于木犀科植物连翘的干燥果实的提取物。

分子式：C₂₇H₃₄O₁₁分子量：534.56

连翘苷属于双环氧木脂素类化合物的葡萄糖苷，熔点184℃～185℃。

研究表明，连翘苷显示多种生物学活性和药理作用。具有具有抗炎解热，抗氧化，降血脂，保肝及神经保护等多种药理活性。

目前建立了多种连翘苷的定性与定量检测和测定分析方法，如薄层层析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色谱法。但含连翘苷的生物样品(包括血浆、尿、唾液等)含有大量的影响含量测定的蛋白质及内源性物质；同时连翘苷可能呈结合状态，必须经过处理，排除内源性杂质和代谢物的干扰，使结合状态的连翘苷游离后才能测定；同时还需要浓缩以满足仪器检测灵敏度的要求，处理程序复杂，费时费力；另外由于连翘苷进入体内后，组织中的分布是极其微量的，即使经过富集，进行含量测定仍是极其困难的。最后，对于连翘苷在靶器官和组织中分布，以及细胞和亚细胞定位的研究，需要通过免疫组织化学和westblot等方法，但由于缺乏连翘苷的抗体，阻碍了此方面的研究。因此，有必要开发出一种用于检侧和测定生物样品中连翘苷的方法，对阐明相关药材或复方的作用机理，以及其体内分布和代谢研究，将具有特别的价值。

发明内容

本发明的半抗原连翘苷可提供确定的结构性抗原决定部位，但是它本身并不具备免疫原性，因此必须要偶联到适宜的赋予抗原性的载体物质上，这样所形成的免疫原才会在注射到宿主动物体内后诱发免疫应答。因此，本发明提供一种如下结构的免疫原：

其中R是0至6个碳的烷基桥(连接半抗原与载体物质的桥)，优选R＝0，即P1直接与连翘苷氧化后的醛基结合，或R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基，更优选R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚烷基。

P1是赋予抗原性的载体物质。载体物质选自蛋白质、蛋白质片合成的多肽或半合成的多肽。其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目镜蛋白和脂蛋白，优选为牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、锁眼形血蓝蛋白(keyholelimpethaemocyanin，KLH)，更优选自锁眼形血蓝蛋白或牛血清蛋白(BSA)。合成多肽或半合成多肽是具有足够数量的可利用氨基的合成聚氨基酸，优选多聚赖氨酸。合成或天然聚合物是带有反应官能基的聚合物材料，特别是能够结合到半抗原产生免疫原的碳水化合物、酵母或多糖。

半抗原的制备本发明描述了半抗原连翘苷的糖苷结构中的两个邻羟基经过过碘酸钠氧化为醛基从而与载体物质发生的偶联作用，产生免疫原。偶联物成功制备并纯化后分别经质谱(MS)和核磁共振氢谱和碳谱(1HNMR和13CNMR)确证。

免疫原的合成本发明的半抗原和蛋白质载体的连接可使用本领域己知的任何连接方式。例如过碘酸盐氧化法等。采用过碘酸氧化法制备免疫原时，是将5毫克的半抗原连翘苷溶解在1ml20％甲醇中，加入含有8毫克的过碘酸钠溶液1毫升，室温下反应一个小时，缓慢滴加到10-20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.01mol/L的CBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

合成免疫原的分析方法为了确认载体物质上结合有适当的半抗原，在免疫前，使用紫外分光度法或矩阵辅助紫外激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)对每个免疫原进行评估。连翘苷免疫原反应物和产物的吸收峰相比(200nm-400nm)，可判断是否偶合，并根据反应物和产物的摩尔吸光系数计算偶联物与半抗原的比例。

使用voyagerSTR生物分光度测量方法研究站激光解析质谱与延迟萃取结合进行MALDI-TOF质谱。将每个要分析的等分试样在0.1％的三氟乙酸水溶液中稀释制成1mg/ml的试样溶液。使用芥子酸基质和牛血清白蛋白作为外标分析等分试样(1uL)。