[发明专利]中间补料发酵生产灰树花多糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程与技术领域，涉及一种在摇瓶和生物反应器中生产灰树花多糖的生产工艺。

背景技术

灰树花是一种珍贵的天然真菌，又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗干蘑、云蕈、莲花菌等。灰树花含有多种生理活性物质，如多糖(糖蛋白)、核酸、多酚等，其中，灰树花多糖(糖蛋白复合体)是研究的重点。真菌多糖是继核酸和蛋白质之后的另一种有待深入研究的生物大分子物质。药用真菌多糖是主要存在于菌丝体细胞内分泌到细胞外的大分子物质，是很好的免疫调节增强剂，可以从根本上提高机体免疫功能。灰树花多糖的主要单糖组成为D-葡聚糖，此外还可能含有少量的D-木糖、D-甘露糖、D-岩藻糖、L-阿拉伯糖、龙胆二糖、半乳糖等。具有生物活性的灰树花多糖的基本结构带有β-(l-6)侧链的β-(l-3)-D-葡聚糖，分支度约为33%，灰树花多糖的药理活性与组分中基本结构的含量有关。在灰树花药用价值被广泛揭示的同时，灰树花的产量和质量成为抑制灰树花应用的瓶颈，因为在自然界中野生的灰树花十分稀少，其灰树花多糖远不能满足人们的需要。于是人们开始栽培灰树花，然而人工栽培灰树花从播种到收获一般需要两到三个月，占地面积大，而且灰树花的产量与质量易受环境气候及虫害的影响。同人工栽培灰树花相比，发酵法生产灰树花多糖由于生产周期短（一般为十几天）、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。发酵法生产所存在的问题是如何提高生物量和产量以及设备的单位体积得率，从而降低成本。批培养所获得的生物量和具有生物活性的多糖产量较低。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种中间补料发酵生产灰树花多糖的方法。

本发明的中间补料发酵生产灰树花多糖的方法通过以下技术方案实现，包括：

菌种来源：

中国微生物菌种保藏管理中心提供并鉴定，Grifolafrondosa，保藏编号Gf-1，菌株别号ATCC60891。

培养方法：

用上述菌属的菌种采用摇瓶补料培养法和生物反应器补料培养法，以葡萄糖或蔗糖为碳源、蛋白胨和酵母粉为氮源作为种子培养基，并加入适量的无机盐和维生素，将菌种接种到液体培养基，通过液体发酵而获得含有灰树花胞外多糖的发酵液以及含有灰树花胞内多糖的灰树花菌丝体。现分别叙述如下：

1、摇瓶补料培养法

接种50-1500毫克干重/升种子于有培养基的摇瓶中，24-28度，80-180转/分钟回旋培养，当残余糖浓度为30-0.1克/升时，补加5-60克/升的葡萄糖或乳糖或麦芽糖，继续培养，在第10-30天结束培养，收获菌丝体和发酵液。在补料培养阶段细胞量增加，同时也有利于灰树花胞外多糖、胞内多糖的合成；

2、生物反应器补料培养法：

接种50-1500毫克干重/升种子于有培养基的生物反应器中，24-28度，通气速率为0.02-3.50升/分钟，搅拌速率10-1000转/分钟，培养液中溶解氧浓度为5%-80%。培养4-30天。当残余糖浓度为30-0.1克/升时，补加5-60克/升的葡萄糖或乳糖或麦芽糖，在第10-30天结束培养，收获菌丝体和发酵液。在补料培养阶段细胞量增加，同时也有利于灰树花胞外多糖、胞内多糖的合成。

培养基可以采用常规的含有碳源、氮源、无机盐和维生素等成分的培养基。其中：碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、糖蜜或土豆汁等；氮源有酵母粉、蛋白胨、酪蛋白或黄豆粉等；无机盐包括KH₂PO₄、K₂HPO₄和MgSO₄。其中葡萄糖、蔗糖和麦芽糖有利于胞外多糖合成，乳糖有利于胞内多糖的合成。有机氮源有利于细胞吸收利用。

采用常规的分析方法对本发明产物进行分析测试（胞外多糖通过乙醇沉淀法获得；胞内多糖通过碱溶解菌丝体后，乙醇沉淀法获得；以上所说的方法均为现有技术，在许多文献中已有阐述，本发明不再赘述），结果表明，所述的方法可以同时获得灰树花胞外多糖与胞内多糖。细胞干重可达20.89g/升（大于20克干重/升，达到高密度培养）；胞外、胞内多糖分别为1.88克/升、2.48克/升。

本发明生物可达20.89g/升，达到细胞高密度，明显超过以前的文献报道的生物量。

胞外多糖产量为1.88克/升，同其他报道相比较为接近。