[发明专利]一种人松弛素H2前体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种人松弛素H2前体及其制备方法和应用。本发明还涉及经由人松弛素H2前体获得的成熟的人松弛素及其应用。

背景技术

松弛素（Relaxin）做为一种肽类激素，由Frederick Hisaw在研究妊娠期间骨盆带变化时首次发现。松弛素最初被认为是一种妊娠相关激素，在孕妇妊娠期前三月，体循环中的松弛素水平明显上升，同时伴随血流动力学和肾血流改变；同时还具有松弛骨盆韧带，扩张子宫颈，抑制子宫平滑肌自发收缩，参与妊娠期结缔组织的重建等作用。后来研究发现，在非妊娠期的妇女及男性体内多种组织都有松弛素的表达，并且具有广泛的生物学作用，包括血管扩张，有抗炎、细胞外基质重塑、血管生成和抗缺血等作用。目前普遍认为松弛素是一种肽类激素，此类肽家族由7种基因编码，包括松弛素基因RLN1、RLN2和RLN3，及胰岛素样肽基因INSL3、INSL4、INSL5、INSL6。人类RLN2编码的松弛素H2是其功能产物，有较强全身和肾脏扩张血管、增加心输出量，减少体循环阻力、肺毛细血管楔压以及NT-proBNP，改善肾功能来调节心血管反应，对抗对心脏泵血功能有害的机体反应等。人体中松弛素H2是以松弛素H2原的状态表达，松弛素原蛋白一级结构按B-C-A的顺序排列（见图1），其中C链由108个氨基酸残基组成，松弛素原产生后由组织中的转化酶将C链切除后，形成成熟的松弛素H2。松弛素H2由53个氨基酸组成，其结构特征是有两个独立的多肽链( A链和B链) ，其中A链由24个氨基酸残基构成，B链29个氨基酸残基组成；A、B链之间有两对链间二硫键相连，A 链内有一对链内二硫键。临床证据显示，松弛素有舒张血管增加血管顺应性和抗缺血作用；在血压正常和增高的急性心衰患者，松弛素可以改善呼吸困难及其他临床结果，安全性可靠。

由于人松弛素有很好的成药性，具有极高的临床应用价值，需求量日益增大，因此推动了人松弛素H2制备方法的研究。目前最为常见的制备方法主要有以下两种：

1、化学合成法：E.Bullesbach 和 C.Schwabe在1991年及2005年报道了RLX的化学合成方法（J.Biol.Chem.1991,266,10754-10761; J.Biol.Chem.2005,280,14586-14590），松弛素H2的A链采用Fmoc法合成，B链采用Boc法合成，合成过程需要采用氟化氢处理两次，并且需要三步进行肽链A和肽链B的组合，三对二硫键采用不同的保护基和不同的脱保护剂。此制备工艺极其复杂，并且产率仅为1.4％，工艺中要求使用高毒性和危险的氟化氢，不适合规模化生产。

专利US-A-4835251中通过在pH 7至12的氧化条件下将还原游离-半胱氨酸形式的A链和还原游离-半胱氨酸形式的B肽链在水性介质中混合以产生具有生物活性的人松弛素H2。但由于B肽链的水溶性极差，很难在A肽链和B肽链间形成正确的链间二硫键。

Barlos KK等（J Pept Sci. 2010 Apr;16(4):200-11）在2010年报道了采用Fmoc法合成肽链A和肽链B，半胱氨酸的侧链采用同一保护基，二硫键采用随机组合法形成。但此方法依然无法有效提高松弛素2的产率，产率仅为48%。且肽链B的合成工艺复杂，不利于工业化生产。

专利 CN 102180964 A公开了将肽链A和肽链B链接制备松弛素-2固相合成方法。但因链间二硫键经常错配而造成产率较低，并且需多次纯化，工艺依然较复杂，不利于工业化生产。

2、基因工程法