[发明专利]一种基于恒温指数扩增反应与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法及其应用

权利要求书

1.一种基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提供或配置恒温指数扩增反应体系，扩增待测miRNA，通过恒温指数扩增反应扩增待测miRNA，得到扩增产物，其中，所述恒温指数扩增反应体系中包括待测样品和扩增模板；

2)制备金属纳米颗粒，然后采用巯基修饰的捕获探针对所述金属纳米颗粒进行标记，得到捕获探针-金属纳米颗粒复合物；

3)提供报告分子修饰的报告探针；

4)将步骤(1)所得的扩增产物、步骤(2)所得的捕获探针-金属纳米颗粒复合物、以及步骤(3)所述的报告探针进行混合，得到反应液，所述反应液在55～95℃下孵育2～10分钟后，自然冷却到室温，离心、洗涤、去上清，再将沉淀转移到硅片上，自然晾干后进行SERS检测；

其中，步骤(1)所述的扩增模板、步骤(2)所述的捕获探针、步骤(3)所述的报告探针均为单链脱氧核糖核苷酸，所述捕获探针和报告探针互不相同，且不互补；

所述步骤(1)中，所述扩增模板包括X序列和T序列，所述X序列和T序列之间具有切刻内切酶的识别序列；所述X序列与待测miRNA互补，所述T序列包括C序列和R序列，所述C序列为捕获探针的核苷酸序列，所述R序列为报告探针的序列。

2.如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段、VentR exo^–DNA聚合酶或Klenow片段聚合酶。

3.如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述切刻内切酶为Nt.BspQI、Nb.BsmI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI或Nt.BstNBI切刻酶。

4.如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述恒温指数扩增反应采用的时间为10～60分钟。

5.权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的DNA聚合酶的浓度为0.03～0.08U/ul。

6.如权利要求1所述基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的切刻内切酶的浓度为0.2～0.6U/ul。

7.如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述扩增模板中的T序列至少重复1次。

8.如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述金属纳米颗粒的大小为12～100nm。

9.如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述报告分子为染料分子。

10.如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法在制备miRNA检测试剂盒中的应用。