[发明专利]茯苓MAPK蛋白编码基因Smk1及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及用转录组数据克隆茯苓MAPK蛋白编码基因Smk 1(PcWSmk)，及其编码产物与应用。

背景技术

药用茯苓是指多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的菌核，它是我国常用的大众药材品种之一，具有极高的药用价值和膳食营养价值，入药能够利水渗湿、益脾和胃、宁心安神。由于茯苓特殊的生态习性，其菌核的生长发育主要依赖于对松木的寄生并吸取其中的碳源、氮源以及其它一些必需的物质，为探索不依赖松木资源的新栽培技术、精准调控菌核形成条件及提高产量，研究茯苓菌核形成相关基因的功能及作用机理具有重要意义。

丝裂原活化蛋白质激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是丝/苏氨酸蛋白质激酶的一个大家族，广泛存在于真核生物中。真核生物的MAPK通路由三级激酶组成，通过级联反应将信号不断放大并传递下去，MAPK是该级联途径的最后一个激酶，既可以作为信号转导的一个环节继续磷酸化下游的成分，又可以进入细胞核激活转录因子进而调节基因表达，在信号转导中的作用非常重要。MAPK信号转导途径在植物病原真菌的生长、发育和致病性调节方面占有非常重要的地位。PcWSmk基因属于MAPK信号通路中的一个基因，在菌核形成起始阶段的表达量达到最高，PcWSmk基因沉默菌株不能形成成熟的菌核。

本申请首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行茯苓的转录组测序及De novo拼接。分析找到茯苓中编码MAPK的候选基因并进行体外克隆表达，将其通过转基因技术在茯苓中过表达，发现其可加快茯苓菌核的形成及提高产量。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PcWSmk基因及其氨基酸序列。此基因编码的酶在茯苓菌核形成过程中有重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茯苓MAPK蛋白编码基因Smk1(PcWSmk)，其序列为SEQ ID NO.1所示。Smk1在菌核形成过程中具有必不可少的作用，该基因能够加快茯苓菌核的形成。

本发明另一个目的是提供Smk1基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明的最后一个目的在于提供一种茯苓MAPK蛋白编码基因Smk1(PcWSmk)在加快茯苓菌核形成中的应用，还包括增加药用茯苓产量中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种茯苓MAPK蛋白编码基因Smk1(PcWSmk)(以下或称PcWSmk基因)，其制备方法如下：

以茯苓的cDNA作为模板，设计引物P1：5'ATGGAAGACCGAGCAGCGGCGACAA3'；P2：5'TCATTGAGGCCGAGGGCGCGTCACT3'进行PCR扩增，PCR条件如下：

3min,95℃；30s 94℃；and 30s 57℃,1min 72℃ 35个循环；10min,72℃；1min,25℃。

最终获得了PcWSmk基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID N O.2所示。

一种茯苓MAPK蛋白编码基因Smk1(PcWSmk)在加快茯苓菌核形成(提高菌核产量)中的应用，其应用过程如下：

将茯苓MAPK蛋白(SEQ ID NO.2所示氨基酸)对应的基因(优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)通过PEG介导的遗传转化转入茯苓原生质中，然后按常规方式进行茯苓的接种及栽培，可获得高产茯苓菌核的转基因茯苓。

本发明的所要保护的内容还包括：

编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

含有本发明的茯苓MAPK蛋白编码基因Smk1(PcWSmk)或其ORF序列的的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围，包括但不限于pRS314载体，PE×p3300，pBARGPE1,pAN7-1,pAN52-1,pBC-hygro。

含有本发明的茯苓MAPK蛋白编码基因Smk1(PcWSmk)全序列或其ORF序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围，包括但不限于大肠杆菌细胞、农杆菌细胞EA101,EA105,LBA4404、毕赤酵母。