[发明专利]一种检测口蹄疫A型病毒的试剂盒及制备和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测口蹄疫A型病毒的试剂盒，及试剂盒制备方法和这种试剂盒的非疾病诊断目的的使用方法。

背景技术

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的动物急性、烈性传染病，主要危害猪、牛、羊痘偶蹄动物，发病率极高，造成了巨大的政治、经济损失，因此被世界卫生组织（OIE）列为A类传染病的首位。FMDV可以分为7个血清型，即A型、O型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型，每个血清又有许多不同的亚型，且各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫。

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的动物急性、烈性传染病，主要危害猪、牛、羊痘偶蹄动物，发病率极高，造成了巨大的政治、经济损失，因此被世界卫生组织（OIE）列为A类传染病的首位。FMDV可以分为7个血清型，即A型、O型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型，每个血清又有许多不同的亚型，且各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫。

口蹄疫病毒的分型鉴别诊断一直是研究的热点。研究表明，口蹄疫病毒的A、O、Asia 1三种血清型的RNA序列同源性约为70%左右，然而其编码结构蛋白的P1区域的差异比较好，该区域的核苷酸序列也常常被用来进行口蹄疫病毒的分型及进化分析。在病毒的这些基因中，VP1蛋白参与病毒的吸附、入侵、免疫反应，并且与病毒的血清型特异性有关。因此VP1的基因序列通常被用来进行FMDV不同毒株之间的亲缘关系分析，从而研究口蹄疫的分子流行病学规律。准确鉴定分离株种属和弄清其来源将有助于口蹄疫的流行病学分析, 具有重要意义。

由于RT-PCR快速，灵敏和可靠性的优点，该方法已被广泛地用于口蹄疫诊断。近年来各种RT-PCR检测方法已用于早期上皮细胞，细胞培养分离和其组织中口蹄疫病毒RNA的检测(Meyer RF, et al.,1991)。Rodriguez等首次可通过RT-PCR对口蹄疫病毒O型、A型和C型进行分型检测(Rodríguez A, et al.,1992)。自此以后不同血清型特异性引物RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒7个血清型份分型检测(Callens, et al.,1997; Vangrysperre, et al.,1996)。这些检测引物位于口蹄疫病毒基因组的不同位置，包括5'非编码区、开放阅读框和3'端非编码区。为了提高RT-PCR诊断灵敏度，多组引物结合的多重检测也被用于口蹄疫的检测(Giridharan P, et al.,2005; Bao H, et al.,2008)，但是这些RT-PCR方法的灵敏度依然有限，若前期再结合ELISA方法一起使用必然会使该过程更加耗时费力。

最近，实时荧光定量RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒的检测，该方法不需要PCR后期处理（例如凝胶分析）且通过应信号来直接监视目标cDNA的扩增。TaqMan实验的检测效果同抗原结合ELISA的病毒分离实验一样(Reid SM, et al.,2003)。目前，两种不同的实时荧光定量RT-PCR TaqMan实验已普遍使用，一种针对5'非编码区的内部核糖体进入位点（IRES）(Reid SM, et al.,2002)和第二种针对3D（RNA聚合酶）的编码序列。实时荧光定量RT-PCR方法的速度和准确性可以从样品核酸提取到实验建立的计算机操作的偶联进一步提高。这使得该检测适合于主要指示病例诊断和在持续疫情中的检测。实时/定量RT-PCR试验目前在许多发达国家作为一种口蹄疫病毒诊断和定量的常规测试。但是，这些实验不是专门设计用于的区分口蹄疫病毒血清型。已经证明5'端非编码区检测在A血清型病毒的检测中更敏感，而在3D检测试验对检测SAT病毒具有更高的灵敏度(King DP, et al.,2006)。另外，由于探针靶向区域的核苷酸错配，这些检测方法不能检测少量的FMDVs。因此，任何一种单独的检测方法不能100％的检测FMDV。最近，Tam等报道了用于口蹄疫病毒检测和病毒分型荧光多重rRT-PCR检测方法，该方法具有更高的检测灵敏度，但却不能区分某些血清型之间的交叉反应性(Tam S, et al.,2009)。