[发明专利]可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种可定植动物肠道的荧光标记 大肠杆菌及其制备方法。

背景技术

在生物学领域，为了便于跟踪研究，荧光标记方式是最常用的一种。传统 的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导致被观察的细胞死 亡，这叫做“光毒性”，因此大多只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构， 而无直接跟踪进行活体动态的研究。

相比传统的荧光标记，绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein)在一种学名 Aequoreavictoria的水母中发现，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光 线激发下，会发出绿色萤光，且“光毒性”非常弱；所以此后在生物分子学领 域绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报导基因使用；现在可供选择利用的绿色 荧光蛋白的突变体或衍生物有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，蓝色荧光蛋白 (EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)等等。

但是包含绿色荧光蛋白基因的重组受体，一般较难与原始状态下活体组织 的原始细胞竞争。比如，利用载体重组技术标记模式大肠杆菌，如DH5α和TG-1 等非常简单，但该模式大肠杆菌是经过人工改造过的，第一无法定植到动物肠 道内，第二因为需要进行重组表达而使代谢能力降低，所以无法和正常肠道菌 群竞争。因此，现有通过绿色荧光蛋白基因的重组的大肠杆菌，无法良好地实 现实时跟踪检测动物肠道菌在逆境环境下(如不同药物处理)的变化或变异情 况，也不利于掌握动物肠道菌在逆境下的变异规律。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种可以与正常 定植的并与动物肠道其它菌群具有较强竞争性，并能适于逆境环境下便于实时 跟踪检测的荧光标记大肠杆菌。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌制备方法，包括如下步骤：

PCR扩增EGFP基因；

将所述PCR扩增获得的EGFP基因与环状质粒载体重组，得到重组质粒； 所述环状质粒载体为pCR2.1c-TOPO或pTrcHisB；

获取待定植动物肠道的大肠杆菌，并进行感受态处理后形成感受态肠道大 肠杆菌；

将重组质粒导入至感受态肠道大肠杆菌，形成转化工程菌，即为本发明可 定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌。

本发明进一步还提出一种根据上述方法制备的可定植动物肠道的荧光标记 大肠杆菌。

本发明的上述方法步骤综合利用绿色荧光蛋白基因和原始肠道大肠杆菌的 优势，构建出可稳定在动物肠道菌中表达的重组质粒pCR2.1c-TOPO-EGFP(弱 控制型)或pTrcHisB-EGFP(可调控的强控制型)，标记的动物肠道大肠杆菌 可用于示踪研究，实时跟踪检测动物肠道菌在逆境环境下(如不同药物处理) 的变化或变异情况，或用于研究微生物在食物和环境中的生长变化、以及可用 于许多其他相关研究。相比现有标记工程菌，取料于原始肠道大肠杆菌，并且 具有卡那霉素或氨苄青霉素等抗性，逆境环境下可以具有更优的竞争性，并且 其表达还可以通过跟踪需求进行控制。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例可见光和紫外灯下观察质粒pCR2.1c-TOPO-EGFP在 DH5α中的表达结果图；

图2为本发明实施例1和实施例2所获得的可定植动物肠道大肠杆菌体外 培养实验结果；

图3为本发明实施例大鼠肠道大肠杆菌及具有EGFP标记的可定植大鼠肠 道的荧光标记大肠杆菌的体外生长曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌制备方法，包 括如下步骤：

S10，以pEGFP-C3基因为模板，利用特异性设计引物PCR扩增EGFP基 因；