[发明专利]可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌及其制备方法

权利要求书

1.一种可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌制备方法，包括如下步骤：

PCR扩增EGFP基因；

将所述PCR扩增获得的EGFP基因与环状质粒载体重组，得到重组质粒； 其中，所述环状质粒载体为pCR2.1c-TOPO或pTrcHisB

获取待定植动物肠道的大肠杆菌，并进行感受态处理后形成感受态肠道大 肠杆菌；

将重组质粒导入至感受态肠道大肠杆菌，形成转化工程菌，即为可定植动 物肠道的荧光标记大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌制备方法，其 特征在于，当所述环状质粒载体为pCR2.1c-TOPO时，所述PCR扩增EGFP基 因在步骤中的PCR引物包括上游引物TOPO-P1和下游引物TOPO-P2；

所述上游引物TOPO-P1具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列；

所述下游引物TOPO-P2具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列；

当所述环状质粒载体为pTrcHisB时，所述PCR扩增EGFP基因在步骤中 采用的PCR引物包括上游引物TcrB-P1和下游引物TcrB-P2；

所述上游引物TcrB-P1具有序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列；

所述下游引物TcrB-P2具有序列表SEQ.ID.No.4的碱基序列。

3.如权利要求2所述的可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌制备方法，其 特征在于，将所述PCR扩增获得的EGFP基因与环状质粒载体重组步骤包括：

将所述PCR扩增获得的EGFP基因采用sacl和BamHI进行双酶切处理；

将所述环状质粒载体采用sacl和BamHI进行双酶切处理；

将所述EGFP基因双酶切产物和所述环状质粒载体双酶切产物用DNA连 接酶进行连接处理，连接产物即为重组质粒。

4.如权利要求2所述的可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌制备方法，其 特征在于，将所述PCR扩增获得的EGFP基因与环状质粒载体重组步骤包括：

将所述PCR扩增获得的EGFP基因采用sacl和BamHI进行双酶切处理；

将所述环状质粒载体采用sacl和BamHI进行双酶切处理；

将所述EGFP基因双酶切产物和所述环状质粒载体双酶切产物用DNA连 接酶进行连接处理，得连接产物；

将大肠杆菌DH5α进行感受态处理后得感受态大肠杆菌DH5α，并将感受 态大肠杆菌DH5α与所述连接产物进行转化，得转化产物；

将所述转化产物用含有抗生素的大肠杆菌培养基筛选，得到耐抗生素的大 肠杆菌DH5α；其中，当所述环状质粒载体为pCR2.1c-TOPO时，所述抗生素 为卡那霉素；所述环状质粒载体为pTrcHisB时，所述抗生素为氨苄青霉素；

从所述耐抗生素的大肠杆菌DH5α中抽提质粒，并用双酶切和基因测序鉴 定筛选出携带有目的EGFP基因的环状质粒载体，即为重组质粒。

5.如权利要求1至4任一项所述的可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌制 备方法，其特征在于，将所述将重组质粒导入至感受态肠道大肠杆菌，步骤包 括：

从待定植动物粪便样品中获取敏感大肠杆菌菌株，并进行感受态处理后获 得感受态动物肠道大肠杆菌；

将携带有目的EGFP基因的重组质粒导入所述感受态动物肠道大肠杆菌， 得转化态动物肠道大肠杆菌；

将所述转化态动物肠道大肠杆菌用含有抗生素的大肠杆菌培养基筛选，得 到耐抗生素的动物肠道大肠杆菌，即为可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌； 其中，当所述环状质粒载体为pCR2.1c-TOPO时，所述抗生素为卡那霉素；所 述环状质粒载体为pTrcHisB时，所述抗生素为氨苄青霉素。