[发明专利]一种CYP2D6基因多位点突变检测方法

权利要求书

1.一种CYP2D6基因多位点突变检测方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)提取CYP2D6基因组DNA作为模板；

(2)设计特异性引物和探针：

CYP2D6*2的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示；

CYP2D6*3的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记缺失型探针，核苷酸系列如SEQ ID NO:7～8所示；

CYP2D6*4的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示；

CYP2D6*5在基因缺失时的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:15；

CYP2D6在基因重复时的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

参比基因ALB的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；

CYP2D6*9的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示；相应的探针分别为5’端HEX标记野生型探针和5’端FAM标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:21～22所示；

CYP2D6*10的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示；

CYP2D6*14的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:27～28所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:29～30所示；

CYP2D6*41的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:33～34所示；

(3)荧光定量PCR反应：

所述荧光定量PCR反应的反应体系为：

浓度为100ng/25μL、体积为1～5μL的步骤(1)所述模板；

浓度为0.5μM、体积为1.25μL的步骤(2)所述引物；

浓度为0.25μM、体积为0.625μL的步骤(2)所述探针；

12.5μL的2×qPCR Master Mix；

补加ddH₂O至反应体系的总体积为25μL；

所述荧光定量PCR反应的反应程序为：

(i)95℃，10min；

(ii)95℃，10s；

(iii)58℃，45s；

(iv)37℃，10s；

其中，(ii)和(iii)进行40个循环；

(4)检测结果判定。

2.权利要求1所述CYP2D6基因多位点突变检测方法，其特征在于步骤(4)中所述步骤(4)检测结果的判定方法如下：

(1)CYP2D6基因置换突变和缺失突变：当PCR结束后，如反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线且拐点清楚，无模板阴性对照无平滑扩增曲线且循环数大于38，则为检测成功；野生型只检测出野生序列探针的扩增曲线且循环数小于35；纯合突变型只检测出突变序列探针的扩增曲线且循环数小于35；杂合型检测出野生序列探针的扩增曲线和突变序列探针的扩增曲线且循环数均小于35；

(2)CYP2D6基因缺失和基因重复：采用标准曲线法和相对CT法测定CYP2D6拷贝数，用基因型为CYP2D6*1/*1的DNA标品作系列稀释制备标准曲线，得到标准曲线的相关系数达0.99以上，斜率在3.1～3.55内，假设样本白蛋白基因有正常的双拷贝数，根据标准曲线计算样本的基因拷贝数，标准化单体型CYP2D6基因拷贝数定义为N＝CYP2D6拷贝数/ALB拷贝数，当N＝0.8～1.2时为正常双单体型样本，N＝0.35～0.6时为基因缺失的单体型样本，当N＝1.4～2.4时为1个基因重复。

3.一种用于检测CYP2D6基因多位点突变的试剂盒，其特征在于所述试剂盒是利用权利要求1所述的检测方法检测。