[发明专利]一种狂犬病人免疫球蛋白制备工艺

权利要求书

1.一种狂犬病人免疫球蛋白制备工艺，它依次包括低温乙醇压滤法、层析法、超滤法、纳米过滤法和洗烘灌联动分装工艺技术提取分离免疫球蛋白，其特征在于制备工艺如下：

（1）组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的制备

将检疫期检疫合格的人血浆离心，离心出液温度控制在0~4℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将其上清液输送至蛋白分离反应罐，使蛋白液的温度在1～3℃之间，缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液调节pH值为6.70～7.20；加-15℃以下的95％或50％乙醇，使乙醇终浓度至8％（V/V），温度控制在-1～-3℃，加完乙醇后pH值为6.80～7.20；制得物搅拌30min以上，进行离心，离心出液温度控制在-1～-3℃，离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清液；组分I沉淀存放于冷库或直接用于纤维蛋白原生产；组分I上清液加入pH4.0醋酸缓冲液中，调节pH值至6.7～6.9；加-15℃以下的95％乙醇至乙醇浓度为20％（V/V），温度控制在-4～-6℃；加完乙醇后pH应为6.80～7.00；搅拌120min以上后，静置60min以上，再开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，组分Ⅱ+Ⅲ上清液用于人血白蛋白生产；

（2）精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的制备

组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，加入10～15倍量的注射用水，用NaCl调整其钠离子浓度为0.01mol/L；开启搅拌，降温至3～5℃，将组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解；在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5. 80～5.85，反应液温度为0～-1℃，加完缓冲液，继续搅拌至少10min；开启制冷循环，加-15℃以下的95%乙醇，使反应液最终的乙醇浓度为19%；反应液最终温度控制在-4～-6℃，加完乙醇继续搅拌2h，静置4h以上进行压缩过滤；先用-4℃以下的压缩空气缓慢吹出滤器中的水，启动反应罐搅拌器，使硅藻土与反应液混匀10min以上边搅拌边过滤，在过滤过程中保持出液温度为-4～-6℃，过滤压力不超过0.2Mpa，收集精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀；

（3）精制组分Ⅲ上清液的制备、层析

精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，加入10～15倍量的注射用水，用NaCl调整其钠离子浓度为0.01mol/L；开启搅拌，降温至2～4℃时，将精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解；在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5.1～5.4，反应液温度为0～-1℃，加完缓冲液，继续搅拌至少10min；开启制冷循环，加-15℃以下的95%乙醇，使反应液最终的乙醇浓度为17%；反应液最终温度控制在-5～-7℃，pH为5.2～5.4，加完乙醇继续搅拌2h，静置4h以上进行压缩过滤；先用-5℃以下的压缩空气缓慢吹出滤器中的水，启动反应罐搅拌器，使硅藻土与反应液混匀10min以上边搅拌边过滤，在过滤过程中保持出液温度为-5～-7℃，得组分Ⅲ沉淀和组分Ⅲ上清液；组分Ⅲ上清液计量后，启动反应罐搅拌器和制冷循环，控制温度为-5～-7℃，进行深层过滤，过滤出液温度控制在-5～-7℃，过滤后用1.0mol/L的HCl调节pH为4.0左右；浓缩蛋白浓度至5%以上，用5倍体积2～8℃注射用水进行透析，透析即得精制组分Ⅲ上清液；

将蛋白浓度调整至3～6%，用0.5mol/L的NaOH调pH至6.4～6.6，然后加1mol/L磷酸-NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.18～0.22s/m，调节好后用离子交换柱进行上柱层析纯化，层析使用DEAE Sepharose FF填料；层析完毕用1.0mol/L的HCl调节pH为3.8～4.0，开启超滤机浓缩至5%以上，用2～8℃注射用水进行透析，使乙醇含量≤0.025%，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将计算量的麦芽糖加入蛋白液内，用1.0mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10±1%，pH为3.9～4.3，蛋白含量5.5±0.5％；

（4）病毒灭活、去除

蛋白液于6h内进行除菌过滤；除菌过滤后制品放置在低pH孵放室，经24±1℃低pH孵放21天；孵放结束后用DV50滤芯除病毒过滤；

（5）超滤、稀配、分装、灯检、包装、入库

过滤后蛋白液，用2～8℃的0.85%NaCl溶液超滤，进行五倍等体积洗涤，洗涤结束后浓缩、稀配，调整甘氨酸为26～30g/L，调整制品pH值为6.6～7.2，狂犬病抗体效价≥100IU/mL；

稀配蛋白液经0.2μm除菌滤芯过滤分装；分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；

所述pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9mL质量浓度为99%冰乙酸和65.6g乙酸钠；

所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数。