[发明专利]一种LAMP法检测石蜡包埋肝组织中HBV cccDNA的引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，具体地涉及一种LAMP法检测石蜡包埋肝组织中HBV cccDNA的方法和试剂盒。 

背景技术

目前临床应用最多的检测乙肝病毒的指标是血清中HBV DNA的检测，但是许多临床和实验研究表明，一些乙肝病人应用抗病毒药物治疗后血液检查HBV DNA虽然已经呈阴性，但是肝组织炎症活动度并未缓解，还有部分患者出现耐药而导致反跳现象，这是因为患者病毒复制的“老巢(HBV cccDNA池)”并未被清除，因此检测HBV cccDNA是评价抗HBV疗效的或临床治疗终点的一项重要标准，也是评价HBV感染状态及传染性的客观指标。由于肝组织来源困难，目前国内关于HBV cccDNA的研究多为血清，各实验的研究结果也不尽相同，对于外周血单核细胞到底存在HBV cccDNA与否说法不一，但是对于肝组织中存在HBV cccDNA池，得到了许多研究者的证实[1]。目前尚没有可以进入细胞核内，能清除HBV cccDNA的药物，这也是现有抗病毒药物疗效不佳且易复发的原因之一。肝脏以外器官组织可能存在HBV cccDNA，成为肝移植术后乙肝复发的来源[2]。目前还没有稳定可靠的的敏感的HBV cccDNA检测试剂盒。基于以上观点，提出利用环介导等温扩增(LAMP)法用于检测乙型肝炎病毒患者肝组织HBV cccDNA，为研究乙型肝炎致病机制和评价抗病毒药物疗效提供一种简便易行的检测方法。 

目前HBV cccDNA的检测方法有以下几种：①选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)选择性PCR根据HBV DNA与HBV cccDNA结构上的差异，通过设计一对特殊的跨双缺口引物，选择性的只扩增cccDNA，松弛环状的(rcDNA)不被扩增；由于PCR产物自身退火的原因导致此种方法并非万无一失。②选择性实时荧光定量PCR[3]，与定性方法相比较增加了与cccDNA负链(rcDNA负链缺口下游)互补的荧光探针，使cccDNA能够检测到扩增信号而rcDNA不能被检测，此种方法同样存在PCR产物自身退火而引起松弛环状的(rcDNA)被扩增，且在HBV DNA＞108拷贝/ml，容易出现假阳性。③侵入者探针法。使用侵入探针和引物探针，通过裂解酶特异性切割5’端碱基片段使之与荧光共振能量转移盒结合，裂解酶再切割荧光共振能量转移盒上荧光基团的短臂，发出荧光信号。其特点是一个模板可重复使用，结合-裂解-结合-裂解，循环一次产生一次信号，呈线性信号放大。优点是特异性较强，缺点是敏感性较差，低于10⁴拷贝/ml无法检测。 ④滚环联合荧光定量扩增法[7]。有学者针对cccDNA为共价闭合环状的DNA,提出用phi29酶(只扩增环状DNA的一种酶)来扩增环状的cccDNA,然后用荧光定量来达到检测的目的，其优点是特异性、敏感性均较高，但是由于滚环扩增是在恒温的状态下进行16-18小时的扩增，因此耗时较长，且phi29酶的价格亦较昂贵，用于临床可能会增加患者的负担。⑤原位滚环扩增法。为使扩增的HBV cccDNA能够直观可见，周冬青等[4]用肝组织的石蜡包埋切片采用PSAD酶消化后再用原位滚环扩增联合原位PCR的方法检测肝组织中的HBV cccDNA，研究虽然证实了肝组织中确实存在HBV cccDNA，具有直观、可靠、形象的优点，但是原位滚环扩增对技术要求过高，且操作亦较繁琐，直接用于临床其难度较大。 

王丽等在《DNA环介导的恒温扩增法在快速鉴定病原微生物中的应用》一文提出LAMP对于病原微生物的鉴定具有高效率、高特异性、高敏感性特点[5]。 

熊新华在《DNA环介导恒温扩增技术在乙型肝炎病毒表面抗原基因检测中的应用》一文中认为环介导恒温扩增技术(LAMP)能快速、特异地检测乙肝病毒表面抗原基因，且实验仪器简单，不需要特殊的设备[6]。 

俞勇等在尝试使用RT(逆转录)-LAMP用于输血前检测HCV RNA的研究中发现，与酶联免疫法检测抗HVC相比，RT-LAMP检测HCV的方法具有快速、灵敏度高的特点[7]。 

Cai Z等在2011年的《临床病毒学》杂志中发表了《一种新的环介导扩增基因型技术用来检测乙型肝炎病毒基因型B型和C型》一文，文中详细介绍了LAMP在检测乙型肝炎病毒基因型方面的应用[8]。 

Cai T等将LAMP作为HBV DNA定量检测和管理的一种新工具，并进行评估[9]。 

Wang C等用RT-LAMP快速检测丁型肝炎的基因型，获得了成功，达到了预期的实验目的[10]。