[发明专利]一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法。

背景技术

根瘤菌-豆科植物构成的共生体系是自然界生物固氮效率最高的体系，其固氮量占整个生物固氮量的3/4，成为农业生产的主要氮源，大豆与大豆根瘤菌的共生体系是生物固氮中的典型代表。利用大豆根瘤菌接种豆科植物以提高其固氮效率已有100多年历史，作为一项节本增效的农业措施，在许多国家得到了广泛的应用。然而，作为大豆起源地的中国，大豆根瘤菌的接种面积仅占大豆种植面积的2％左右，远低于美国、巴西、阿根廷等主要大豆主产国70％以上接种率。其主要原因是具有高效匹配和竞争结瘤能力的优良菌株的筛选和根瘤菌竞争结瘤过程中与豆科植物根系分泌物间信号识别的“分子对话”研究滞后于生产，导致接种根瘤菌的竞争结瘤能力差，土壤中存在大量的土著根瘤菌群，干扰和降低了接种根瘤菌的占瘤率，致使接种根瘤菌剂的增产效果不显著，制约了其应用和发展。

大豆根瘤菌的竞争结瘤是以大豆宿主与大豆根瘤菌菌株之间可扩散复杂信号分子的特异识别为基础的复杂调控过程，这一过程受到一系列由大豆品种和根瘤菌菌株双方提供的信号分子的严格调控。研究表明，根瘤菌的竞争结瘤决于菌株自身产生的不同NodD调节蛋白与豆科植物根系不同分泌物组分的早期相互作用，大豆苷元和染料木黄酮是一类能影响根瘤菌结瘤的黄酮物质。为了响应豆科植物分泌的类黄酮类物质，根瘤菌可以合成宿主特异的(LCOs)作为精确外源结瘤因子，从而启动根瘤菌和宿主的早期识别。特异结瘤因子的物质骨架都是由普通的nod基因(nodABC)合成，而后进一步被其他nod基因所编码的蛋白质所修饰。根瘤菌中NodD(原核生物LysR家族转录调节因子)通过与宿主特异的类黄酮进行相互识别，能够激活结瘤基因的表达。

大豆根瘤菌nod基因的表达受到宿主大豆根系分泌物的影响，很多研究大多采用类黄酮类纯物质、大豆苷元或大豆幼苗根系提取物来代替大豆根系分泌物，但实际上，豆科植物根系分泌物组分复杂，截至目前，已发现豆科植物根系分泌物中的类黄酮种类已超过4000种，某些单一的纯组分或几种纯组分的复合虽然能够影响大豆根瘤菌nod基因的表达，但研究结果有一定的片面性；大豆苷元及大豆幼苗根系提取物能够影响根瘤菌竞争结瘤，但在其制备过程中，还包含了大豆根系组织，并不能真正模拟大豆根系中的实际环境；除此之外，目前已报导的大豆根系分泌物的收集大都集中在收集装置的设计上，对培养条件和收集时间上存在较大的主观性，其组分和浓度未知，有效性也无法评价，在一定程度上制约了研究的深入。因此，建立大豆根系分泌物的制备方法，并对其有效性进行评价，对研究大豆根系分泌物与根瘤菌的互作、大豆根瘤菌nod基因表达的分子调控机制以及高效菌株的筛选具有重要的理论价值和实践意义。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法，包括下述步骤：

(1)、对大豆种子先用蒸馏水洗净，放入95％的酒精中浸泡1min，转至5％次氯酸纳溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗至少10次；

(2)、将经过表面灭菌的大豆种子在无菌条件下移至YMA琼脂表面皿中催芽，待种子发芽后，移至灭菌的浓度为30％的无氮Rigaud-Puppo营养液进行培养，在培养第12天收集大豆根系分泌物，即得高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物；其中培养条件为：白天30℃、16h光照，光照强度为960μmol·m^-2·s^-1；夜间15℃、8h黑暗。

上述技术方案所述的一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法，其中，YMA培养基组成为：甘露糖醇10.0g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、NaCl0.1g、酵母粉0.8g、CaCO₃1.5g、浓度为0.5％的刚果红5ml、琼脂15-20g、H₂O 1000ml；YMA培养基pH值为6.8～7.0。