[发明专利]一种测定大豆对草甘膦耐性的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种测定大豆对草甘膦耐性的方法以及应用。

背景技术

杂草迅速消耗土壤中作物和其他目的植物所需的养分，杂草每年给作物生产带来巨大损失。当前有多种类型的除草剂用于控制杂草，草甘膦是使用面积最大的一种除草剂，近年来随着草甘膦使用，田间杂草的耐药性增强，为此，多种除草剂联合施用，降低杂草耐药性，成为田间管理的一种规范。

抗除草剂转基因作物，特别是抗草甘膦转基因作物在目前种植的转基因作物中占比例最大，并且种植规模逐年扩大(James,Clive.2013.Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops:2013.ISAAA Brief No.46.ISAAA:Ithaca,NY)。我国是转基因大豆的进口大国，研制具有自主知识产权的抗除草剂转基因作物，具有极大的经济价值与国家粮食安全作用。当前转基因植物的安全性问题主要是由于异源微生物基因、启动子、终止子的导入所引起的，因此，开发植物内源耐性基因，实现基因组水平上对内源基因的工程修饰，是转基因技术发展的前沿，而这需要通过对杂草或者作物本身除草剂耐性基因的挖掘与利用来实现，在这一过程中更需要借助灵敏而有效的除草剂耐性的生物学测定手段。为此，建立一种广为适用的除草剂耐性鉴定方法，就显得尤为重要。

除草剂生物测定在除草剂的研制、应用过程中占有重要地位。除草剂的筛选、除草活性、杀草谱确定、除草剂对作物的安全性及其是否存在残留药害等诊断，都离不开生物测定。除草剂的生物测定广义的包括了实验室、温室和大田三个试验层次，而狭义的仅主要指前两者，后者则为田间药效评价。快速鉴定外源基因表达在转基因作物研究中具有重要的作用。

当前抗草甘膦转基因作物的检测方法主要集中在PCR扩增靶标基因的分子检测法和田间(或温室)整株喷施鉴定法。PCR扩增靶标基因法由于仪器、试剂要求精确，成本较高，专一性强，并且对于扩增条件需要摸索，且只是针对靶标基因进行检测，并不能验证靶标基因的表达与否。后者虽然直观，但所需时间比较长、工作量大，且易受季节影响。喷施处理关键技术是除草剂配药浓度正确、喷施均匀、选择合适的施药时间、最终调查鉴定结果判断植株的耐受性程度，这对于操作者的喷药技术以及田间调查的要求很高。此外，如果在温室中进行喷施处理，则受到空间场地以及栽培器皿的限制，很难使用喷雾器喷雾处理以达到单位面积上均匀用药，从而导致实验结果重复性差，容易造成表型鉴定结果的假阳性或者假阴性。而实验室内的除草剂耐性鉴定往往借助种子萌发与含有除草剂的试纸或者培养基中，很难确定单个植株上的除草剂的用量。

总之，植株喷洒除草剂受环境条件(温度、光照、风力、降水、营养等)和人为因素影响较大，生理性病害和除草剂伤害不易区分，往往干扰了除草剂植株鉴定的准确性，而具有鉴定效果直观明了、操作简单、实验周期短等优点的除草剂生物学方法将在检测转基因或者转基因飘逸方面具有潜在的应用前景(武淑香，姜志磊，孔祥梅等，抗除草剂转基因玉米育种筛选方法的建立，分子植物育种，2008，6(1)155-160；李欣，杜丽璞等；转Bar基因小麦和非转基因小麦抗除草剂鉴定方法比较，植物遗传资源学报2012,13(4)：596-600)。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定大豆对草甘膦耐性的方法及应用。

本发明所提供的测定大豆对草甘膦耐性的方法，涉及一种不同于现有技术的向待测植株施用草甘膦的方法，该方法称为点施法(dot-scanning method)，具体包括如下步骤：

取种子萌发出土后的待测大豆植株(如种子萌发出土2天内的待测大豆植株)，将草甘膦原液或稀释液滴加于所述待测大豆植株的绿色组织(如下胚轴的钩状弯曲的外侧)。所述草甘膦原液或稀释液的滴加剂量可为1μl。

本发明还提供了一种用于测定大豆对草甘膦的半抑制浓度(IC50)的方法。

本发明所提供的用于测定大豆对草甘膦的半抑制浓度(IC50)的方法，具体可包括如下步骤：

(1)用无菌水将草甘膦原液按照10倍比梯度稀释，得到4个稀释倍数的草甘膦稀释溶液：10倍，100倍，1000倍，以及10000倍；所述草甘膦原液的稀释倍数记为1倍；

(2)取种子萌发出土后的待测大豆植株(如种子萌发出土2天内的待测大豆植株)，分为实验组和对照组，分别按照如下进行点施处理：

实验组：取步骤(1)中制备的不同稀释倍数的草甘膦溶液1μl，分别滴加于所述待测大豆植株的同一绿色组织的同一部位；