[发明专利]人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子点分别标记的兔抗I型、II型以及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体的混合物；所述检测层是由带有第一检测线、第二检测线、第三检测线以及质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述第一检测线、第二检测线以及第三检测线分别包被有鼠抗I型、II型以及III型人副流感病毒多克隆抗体；所述质控线包被有抗兔IgG；所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。

2.根据权利要求1所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点。

3.根据权利要求1或2所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述检测层长4cm，所述检测层粘贴在长度是8.6-9.5cm的底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm；所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2—0.4cm；所述第一检测线、第二检测线、第三检测线以及质控线中相邻两线之间的间距均是0.5-0.8cm；所述底板的宽度是0.3-0.5cm。

4.根据权利要求3所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。

5.根据权利要求4所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。

6.一种基于如权利要求1-5任一权利要求所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

1)结合垫的制备：

1.1)重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白的制备、纯化以及复性：

1.1.1)对I、II以及III型人副流感病毒HN蛋白进行生物信息学分析，分别获取I、II以及III型人副流感病毒HN蛋白的胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段；

1.1.2)找到步骤1.1.1)中所得到肽段对应的基因编码序列，根据大肠杆菌中密码子的偏好性，对步骤1.1.1)中所得到基因编码序列进行密码子优化；

1.1.3)在步骤1.1.2)中所得到的基因序列的5’端及3’端分别引入酶切位点并分别化学合成全基因序列，同时标记记为hn1、hn2以及hn3；

1.1.4)将步骤1.1.3)中所得到的hn1、hn2以及hn3按分子生物学方法分别克隆入表达载体pET-28a(+)后表达重组融合蛋白HN1-His、HN2-His及HN3-His；所述重组融合蛋白HN1-His、HN2-His及HN3-His均以包涵体形式存在于基因工程菌菌体内；

1.1.5)用镍柱分别纯化步骤1.1.4)所得到的包涵体蛋白，再分别对包涵体蛋白进行复性即得到所需重组蛋白；

1.2)重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备：

1.2.1)以步骤1.1.5)中所得到的复性的重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白为完全抗原，免疫新西兰大白兔及豚鼠，分别制备兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清；所述兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×10⁵；

1.2.2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；

1.2.3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.2.2)所得到的抗体浓度，同时将该浓度调整至3mg/mL后备用；

1.3)量子点分别标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备与纯化：

1.3.1)向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺和300nmol碳二亚胺，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm/min，37℃反应30min后，透析去除过量的N-羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L以及氯化钠2g/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；

1.3.2)在活化的量子点中，加入4-8nmol的步骤1.2)所制备的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇至终浓度为1.5％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；用0.2μmPES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物；收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液中；

所述磷酸盐洗涤液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L、氯化钠2g/L、吐温-205ml/L以及叠氮钠1g/L，所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.3；所述磷酸盐保存液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L、氯化钠2g/L、BSA10g/L以及叠氮钠1g/L，所述磷酸盐保存液的pH＝7.3；

1.3.3)按照与步骤1.3.1)以及步骤1.3.2)相同的方法，分别利用步骤1.2)所制备的兔抗重组HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别制得量子点标记的兔抗重组HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG；

1.3.4)将量子点标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG按体积比1：1：1混合后备用；

1.4)量子点标记抗体的负载：

将聚酯纤维膜浸入步骤1.3.4)所得到的量子点分别标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合液中1h，取出，25℃干燥后4℃密封保存备用，至此制得结合垫；

2)样品垫的制备：

取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，25℃密封干燥保存；至此制得样品垫；

所述样品垫处理液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L、氯化钠2g/L、牛血清白蛋白20g/L、吐温-2010mL/L、蔗糖20g/L以及聚乙烯吡咯烷酮5g/L，所述样品垫处理液的pH＝7.3；

3)检测层的制备：

3.1)将步骤1.2.2)中制备的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度为0.5-2.5mg/mL，所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L以及氯化钠2g/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；

3.2)将稀释好的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm的量按照一定间隔依次喷于硝酸纤维素膜上，形成第一检测线、第二检测线以及第三检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线；

3.3)将喷有第一检测线、第二检测线、第三检测线以及质控线的硝酸纤维素膜在37℃干燥2h，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；

4)底板的制备

将PVC材质的底板按实际要求裁剪后备用；

5)吸水垫的制备

将吸水滤纸按实际要求裁剪后备用；

6)人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡的组装：

6.1)将步骤4)所制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉；

6.2)将步骤3)所制备得到的检测层粘贴到底板的中部区域，并抹平膜面；

6.3)将步骤5)所制备得到的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层有部分重叠，同时将其右边缘与底板的右边缘对齐粘好并抹平；

6.4)将步骤1)所制备得到的结合垫按部分重叠的方式重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，同时将结合垫粘于底板上；

6.5)将步骤2)所制备得到样品垫则按部分重叠的方式重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；

6.6)将组装好的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡进行裁剪，4℃密封干燥避光保存；

所述步骤6.1)至步骤6.6)均是在生物安全柜内进行操作。