[发明专利]一株共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸，又名3-苯基乳酸或β-苯乳酸，是近年来发现的一种新型天然防腐剂，它具有较广的抑菌谱，不仅能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，对引起食物腐败的多种霉菌等真菌也有明显的抑制作用，且安全性能高，在食品工业中具有较好的应用前景。此外，苯乳酸还是多种药物的前体，苯乳酸的衍生物丹参素(3,4-二羟基苯基乳酸)具有抑制血小板凝集和扩张冠状动脉的作用，因而具有重要的医药应用价值。苯乳酸α位的碳原子是手性碳原子，故有两种对映体，L-苯乳酸和D-苯乳酸。L-苯乳酸和D-苯乳酸具有不同的光学性质，也具有不同的生物活性。

苯乳酸合成方法有化学合成法和生物转化法两种。由于化学合成法具有技术复杂、污染环境等缺点，目前更多的是采用生物转化法，主要包括乳酸菌发酵和酶催化。乳酸菌发酵合成苯乳酸过程中，不仅同时有L-苯乳酸和D-苯乳酸生成，还往往伴随乳酸等有机酸的生成，难以获得高光学纯度的L-苯乳酸。体外酶催化反应过程中酶易受外界环境影响，底物耐受性差，活力损失快，同时需要外源添加价格昂贵的辅酶NADH，也不适宜工业应用。目前尚未有简单高效的L-苯乳酸合成技术相关报道。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一株共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述大肠杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述大肠杆菌在催化合成L-苯乳酸中的应用。

为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌，其特征在于，它是导入了来源于凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因ldhL和来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因fdh的大肠杆菌；

其中，所述的L-乳酸脱氢酶基因ldhL，其核苷酸序列的GenBank登记号为KF386111；所述的甲酸脱氢酶基因fdh，其核苷酸序列的GenBank登记号为AJ011046。

以上所述的共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，将来源于凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因ldhL和来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因fdh分别克隆到大肠杆菌表达载体pETDuet-1的多克隆位点1和多克隆位点2处，得到重组质粒pETDuet-ldhL-fdh，将该质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21，利用氨苄青霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)。

以上所述的共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌在催化制备L-苯乳酸中的应用。

其中，所述的应用包括如下步骤：

(1)细胞的准备：将重组大肠杆菌按体积比为0.1～3％的量转接到发酵培养基中，当细胞OD₆₀₀达到0.4～0.8后，加入终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG，在16～30℃继续培养1～12h，培养结束后，收集重组大肠杆菌；

(2)催化方法：将步骤(1)中得到的重组大肠杆菌加入含有苯丙酮酸和甲酸钠的反应体系中，催化制备L-苯乳酸。

其中，步骤(1)中，所述的发酵培养基为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氨苄青霉素100mg/L。

其中，步骤(2)中，反应的温度为在20～70℃，优选为35～55℃，最优选37℃。

其中，步骤(2)中，反应的时间为5min～10h，优选为0.5～2h。

其中，重组大肠杆菌的干菌添加量为1～36g/L，优选为10～30g/L。

其中，步骤(2)中，所述的反应体系，其苯丙酮酸的初始浓度为1～100mmol/L，优选为50～100mmol/L。

其中，步骤(2)中，所述的反应体系，其甲酸钠的初始浓度为1～200mmol/L，优选为100～200mmol/L。

其中，步骤(2)中，所述的反应体系，其初始pH值为3～9，优选为5～7。

有益效果：

本发明具有如下显著的特征和效果：

(1)所得L-苯乳酸光学纯度高，产率高，合成效率高，同时全细胞催化法反应体系成分简单，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。