[发明专利]一种鉴定赖氨酸ε‑氨基侧链单甲基化修饰的方法

权利要求书

1.一种鉴定底物中赖氨酸残基的ε-胺基上发生单甲基化修饰的方法，该方法包括：

1)采用体外氮酰化衍生化反应，将底物上的赖氨酸残基单甲基化ε-胺基衍生为酰甲基化ε-胺基；

2)利用特异性制备的酰甲基化赖氨酸泛抗体亲和富集酰甲基化修饰的肽段；

3)利用质谱和数据分析鉴定抗体亲和富集的酰甲基化修饰的位点和多肽；

其中，所述的酰甲基化赖氨酸泛抗体为丙酰甲基化赖氨酸泛抗体，该方法还包括制备特异性的丙酰甲基化赖氨酸泛抗体，所述的制备特异性的丙酰甲基化赖氨酸泛抗体步骤包括如下步骤：

合成路线为：

其中，NHFMor为保护基团；

合成的具体步骤如下：

(1)、2-1用二氯甲烷(DCM)溶解，常温下持续通入新制HCl气体1.5小时后，强酸下常温继续反应5小时，TLC确认反应结束；旋干后得粘稠固体，然后加硅胶拌样进行柱层析得到2-2；

(2)、2-2加入丙酮溶解，在加入NaHCO₃水溶液后室温搅拌2小时，让其充分搅拌，除去原料中结合的HCl；冰水浴下缓慢加入溶有丙酸酐的丙酮溶液，反应1小时；反应结束后2N盐酸调pH 3.0左右，加入DCM进行萃取，取有机相旋干得粘稠固体，加硅胶进行柱层析得到2-3；

(3)、2-3加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和四氢呋喃(THF)溶解后加入哌啶，常温搅拌过夜，TLC确认反应结束；油泵减蒸蒸干溶剂后得混合产物；加硅胶柱层析纯化得酯化产物；加氢氧化钠、等量水与甲醇体系进行水解，冰水浴下反应2小时，酯化产物完全水解后用2N HCl调至pH 3.0；旋干溶剂，再加入乙醇溶解产物，过滤后滤液旋干，得最终产物丙酰化单甲基赖氨酸小分子，对获得丙酰化单甲基赖氨酸小分子再进行小分子全抗原的制备，然后用制备好的抗原进行免疫动物，以及对免疫动物获得的血清进行抗体的纯化，最终获得特异性的丙酰甲基化赖氨酸泛抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，底物赖氨酸残基单甲基化ε-胺基衍生为丙酰甲基化ε-胺基。

3.根据权利要求2所述的方法，利用丙酰甲基化赖氨酸泛抗体对丙酰甲基化修饰的位点进行富集。

4.根据权利要求1所述的方法，对底物赖氨酸残基单甲基化ε-胺基进行氮酰化修饰，修饰基团的碳原子总数小于8个的烷基或者芳香基。

5.根据权利要求4所述的方法，所述的底物为多肽或者蛋白，酰化反应可以在蛋白酶消化底物之前或者之后进行。

6.根据权利要求5所述的方法，利用相应的底物蛋白酰甲基化赖氨酸泛抗体对酰甲基化修饰的位点进行富集。

7.根据权利要求6所述的方法,所要鉴定的赖氨酸残基ε-胺基发生单甲基化修饰的底物为提取于任何细胞、组织或体液中获得的蛋白或多肽。

8.根据权利要求7所述的方法，提取于任何细胞、组织或体液的底物蛋白质可进行体外的化学衍生化反应；酰化试剂为具有稳定同位素的酰化试剂。

9.根据权利要求8所述的方法，同位素酰化试剂为含碳，氢，氧，氮稳定同位素的羧酸，酸酐，酰氯，羧酸酯，酰胺。

10.根据权利要求9所述的方法，对赖氨酸单甲基化修饰底物的定量分析，可以选择稳定同位素酰化试剂分析三组不同的赖氨酸单甲基化修饰底物；分析所述的三组不同的甲基化修饰底物，可以对其进行¹²C₆H₁₀O₃，¹³C₆H₁₀O₃和¹²C₆D₁₀O₃分别标记。

11.根据权利要求10所述的方法，细胞为可进行基于细胞培养的稳定同位素标记(SILAC)的永生传代的细胞。