[发明专利]一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及检测肠癌驱动基因热点突变的组合物。

背景技术

肠癌是结直肠癌和直肠癌的总称，大肠癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠，近年有向近端(右半结肠)发展的趋势。肠癌的发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切。

研究发现，肠癌的发生与KRAS、BRAF、PIK3CA热点基因的突变有很大的关系。K-ras基因位于12号染色体短臂上，35kb，属于Ras基因家族的一员。在Ras基因中，K-Ras对人类癌症影响最大，它好像分子开关：正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当K-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。K-ras基因检测是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法。看K-ras基因有没有突变，可以筛选出抗EGFR(表皮生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而延长患者生存期。BRAF基因基因编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。在结直肠癌患者中，BRAF基因突变率为15％，美国国家癌症综合治疗联盟《结直肠癌临床实践指南》(V3.2011)建议，在使用爱必妥或帕尼单抗等靶向药物时，须检测肿瘤组织KRAS基因状态，如果KRAS无突变，应考虑检测BRAF基因状态。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是EGFR下游信号分子，可被生长因子受体酪氨酸激酶(如EGFR)激活，使丝/苏氨酸激酶(AKT)磷酸化产生多种生物学效应，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等。研究发现PIK3CA基因产生突变与结肠癌等多种癌症发病存在相关性，32％的结肠癌患者体内基因PIK3CA存在突变而在成胶质细胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌患者中，该基因存在突变的比例分别为27％、25％、8％和4％。NRAS基因是RAS基因家族中的一员，参与细胞内的信号传递。目前，应用于肠癌靶向治疗的药物主要有爱必妥(默克公司)和帕尼单抗(安进公司)，然而靶向药物在不同患者中有不同的疗效，有效率约为20～50％。通过对肠癌患者进行靶基因突变检测，能够科学的判断该病人能否适应靶向药物治疗，指导病人用药，实现病人的个体化医疗。

目前检测基因突变的方法主要有以下几种：

(1)直接测序法。直接测序法是运用探针进行PCR扩增并对扩增产物进行测序和TA克隆并再次测序以最终确定突变的碱基位置。该方法比较繁琐、耗时长，而且由于自身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。

(2)变性高效液相色谱法(DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确认。

(3)高分辨率熔解曲线(HRM)。高分辨率熔解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。

(4)探针扩增阻滞突变法(ARMS)。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物，该检测方法的灵敏度在1％左右。

(5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(CAST-PCR)。CAST-PCR法采用优化TaqMan探针，通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优先扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在0.1～1％左右。

但这些技术的灵敏度都不高，检测的特异性差，误诊率高，不能满足对肠癌检测的需求。

发明内容