[发明专利]基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒，属于生物技术领域。 

 

背景技术

轮状病毒（rotavirus,RV）是世界范围内引发婴幼儿和幼龄动物严重脱水性腹泻的重要原因。轮状病毒性胃肠炎是流行广泛的人兽共患病，尤其是幼龄动物及婴幼儿的一种急性肠道传染病，以腹泻和脱水为特征，病死率可达50%。轮状病毒的基因组由11个不连续的dsRNA片段组成，分别编码6个结构蛋白（VP1～VP4、VP6、VP7）和5个非结构蛋白（NSP1～NSP5）；其中VP7和VP4构成外层衣壳，VP7具有血清型特异性，与致病性有关，可刺激机体产生保护性抗体。VP7是一种N-联低聚甘露糖糖蛋白，为病毒外膜的重要糖蛋白和主要中和抗原，并决定病毒的G血清型。

随着分子生物学技术、核酸分子杂交技术的不断发展，基因检测技术已越来越多的应用于人畜传染病的诊断等诸多领域。这些技术针对待测病毒核酸序列设计特异性引物，具有特异性强、敏感性高、准确性高等优点。PCR技术灵敏度更高，可检测储存较长时间的样本及多样环境样本，其扩增产物可用于基因研究工作。但是目前尚无牛轮状病毒诊断的专用试剂盒。本技术发明根据牛轮状病毒（bovine rotavirus, BRV）VP7的基因保守序列，设计特异性引物，建立了实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法,并在此基础上研发出快速准确的诊断与检测试剂盒。

发明内容

试剂盒组成与保存期    检测试剂盒含VP7基因保守序列特异性引物、特异性荧光探针、逆转录酶、耐热DNA聚合酶（Taq酶）等成分组成，运用实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测。

试剂盒保存期达6个月。

其主要特点       

特异性强，根据VP7基因保守序列设计特异性引物，通过实验验证，本试剂盒可以检测A组病毒，而对BVDV、BCV、PEDV等其它病毒核酸和细菌无任何扩增,阴性对照亦无扩增。（附图1）

灵敏度高，检测的最高稀释度可达10^-5～10^-4。定量检测线性范围可达10^-1拷贝/μL。（附图2）

总之，本检测试剂盒快速、敏感、特异，可用于粪便和血液等多种样本中轮状病毒的定量检测。

附图说明

图1是本技术发明基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒的特异性。

图2是本技术发明基于VP7基因的牛轮状病毒qPCR检测试剂盒的敏感性。

注: M为100bp DNA Marker;  1-2泳道分别为空白和阴性对照;  3-7泳道分别为质粒10倍梯度系列稀释（10³, 10², 10¹, 10⁰和 10^-1)。

具体实施方式

样品采集与处理

(1)组织样品处理。 每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5 mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

（2）全血样品处理。待血凝后取血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

（3）阳性对照处理。取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

（4）阴性对照处理。取阴性对照100 μL，置1.5mL灭菌离心管中。

RNA提取   

取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5min。将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600μL洗液，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。重复此步骤。再空柱13000rpm离心2min。将吸附柱移入新的1.5 mL离心管中，在膜中央加入洗脱液25μL，室温静置1min，13000rpm离心30s，获得总RNA。 

RT-PCR     

每份总体积20μL，含16.8μLRT-PCR反应液(用前混匀)，1.2 μL酶混合液，2μL模板RNA。扩增条件为42℃45 min，95℃3min；扩增条件为95℃30s，60℃30s，72℃25s，35个循环；72℃延伸10 min。