[发明专利]马铃薯金线虫SCAR标记和LAMP快速检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及马铃薯金线虫SCAR标记和LAMP快速检测方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

马铃薯孢囊线虫包括马铃薯金线虫Globodera rostochiensis和马铃薯白线虫G.pallida，是世界上马铃薯毁灭性的病原线虫。目前马铃薯孢囊线虫我国尚未发生，因此列为我国一类进口植物检疫对象。马铃薯金线虫与白线虫的形态学特征非常相似，难与区分，传统的马铃薯孢囊线虫鉴定方法必须借助于一定数量特征性的孢囊或雌虫，并结合2龄幼虫特征进行鉴别，因此马铃薯孢囊线虫检测的专业性特别强，同时还需要有足够数量的标本。为了保护我国农业生产的安全，防止马铃薯孢囊线虫传入我国，开展马铃薯孢囊线虫的特异快速的分子检测技术研究具有重要的现实意义。

马铃薯孢囊线虫的分子鉴定的研究始于上世纪80年代末。分子技术包括RFLP、PCR、RAPD、SCAR-PCR等方法，主要针对马铃薯孢囊线虫的mtDNA或mtDNA-PCR、rDNA-ITS和基于基因组进行鉴定、遗传、检测、致病性和作物抗性等方面的研究。

孢囊线虫种类的鉴别是最早的。Burrow和Boffey(1986)最早应用RFLP直接酶切mtDNA，根据内切酶产物的大小区分马铃薯金线虫(G.rostochiensis)及马铃薯白线虫(G.pallida)。Burrows及Perry(1988)分别构建了马铃薯白线虫(G.pallida)的基因组文库，并筛选出了特异性探针。Flemin等(1993)、Thiery&Mugniery(1996)通用引物rDNA1和rDNA2扩增PCN的DNA，得到一个包括ITS1、ITS区域及5.8S基因序列长1200bp的片段，用限制性内切酶AluI酶切PCR产物能快速区分PCN种。Fleming C.C.等用引物rDNA2和rDNA1.58s然后用Alu I和Hinf I酶切，分析RFLP图谱，可将G.tabacum、G.rostochiensis、G.pallida、H.glycines、H.goettingiana、H.schachtii、H.mani、H.carotae和H.punctata9种孢囊线虫彼此分开。

Folkertsma et al.，1994用RAPD分析了马铃薯白线虫和马铃薯金线虫种间和群体间的遗传变异，并从相关致病型组中分离出马铃薯金线虫群体。Burrow P.R.et al.(1996)分析来自英国的20个G.pallida群体RAPD图谱，证实地理分布与基因组相似性无关。Blok V.C.等和Thiery M.et al.(1997)用RAPD研究球孢囊线虫的遗传变异，结果表明球孢囊线虫种内不同群体的遗传变异极小，但种间的差异性较大。

马铃薯孢囊线虫种特异性引物研究较多，如Mulholland et al.(1996)根据ITS1区域设计出了马铃薯金线虫的特异性引物和马铃薯白线虫的特异性引物，与通用引物进行PCR反应，扩增出238bp马铃薯金线虫DNA片断，扩增出391bp的马铃薯白线虫特异性DNA片断。据此可以区分马铃薯金线虫和马铃薯白线虫。Bulmam&Marshall，1997年根据马铃薯孢囊线虫澳大利亚群体ITS分析结果，设计出了马铃薯金线虫种的特异性引物PITSr3和马铃薯白线虫的特异性引物PITSp4，用PITSr3可以扩增出一个特异性识别马铃薯金线虫的343bp DNA带，用PITSp4可以扩增出特异性识别马铃薯白线虫的265bpDNA片断。

Fullanodo,A.et al.(1999)用随机引物OPG5分别扩增出区分马铃薯金线虫特异性RAPD标记片段为826bp，马铃薯白线虫特异性RAPD标记片段为1100bp。对扩增出的马铃薯金线虫和白线虫的RAPD标记片段进行全序列分析，将RAPD标记转化成SCAR标记，设计出马铃薯金线虫FullGrf和FullGrr以及马铃薯白线虫的SCAR特异性标记引物FullGpf和FullGpr，用FullGrf和FullGrr扩增出了315bp马铃薯金线虫的特异性片段，用FullGpf和FullGpr扩增出798bp的马铃薯白线虫的特异性片段,这是目前已知孢囊形线虫首例RAPD-SCAR标记。