[发明专利]一种猪伪狂犬病等温PCR现场快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种猪伪狂犬病等温PCR现场快速检测试剂盒。

背景技术

猪伪狂犬病PRV是由猪伪狂犬病毒引起的病毒性的猪传染病，新生仔猪感染伪狂犬病毒会引起大量死亡，临诊上新生仔猪第1天表现正常，从第2天开始发病，3～5天内是死亡高峰期，有的整窝死光。同时，发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀，一旦发病，1～2日内死亡。剖检主要是肾脏布满针尖样出血点，有时见到肺水肿、脑膜表面充血、出血。15日龄以内的仔猪感染本病者，病情极严重，发病死亡率可达100％。仔猪突然发病，体温上升达41℃以上，精神极度委顿，发抖，运动不协调，痉挛，呕吐，腹泻，极少康复。断奶仔猪感染伪狂犬病毒，发病率在20％～40％左右，死亡率在10％～20％左右，主要表现为神经症状、拉稀、呕吐等。成年猪一般为隐性感染，若有症状也很轻微，易于恢复。主要表现为发热、精神沉郁，有些病猪呕吐、咳嗽，一般于4～8天内完全恢复。

怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎，其中以死胎为主无论是头胎母猪还是经产母猪都发病，而且没有严格的季节性，但以寒冷季节即冬末春初多发。据近年来的报道，奇痒症状以往在猪罕见，但目前则常可见到。

伪狂犬病的另一发病特点是表现为种猪不育症。近几年发现有的猪场春季暴发伪狂犬病，出现死胎或断奶仔猪患伪狂犬病后，紧接着下半年母猪配不上种，返情率高达90％，有反复配种数次都屡配不上的。此外，公猪感染伪狂犬病毒后，表现出睾丸肿胀、萎缩，丧失种用能力。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种猪伪狂犬病等温PCR现场快速检测试剂盒，本发明的试剂盒由一套设计的引物、10×LAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成。采用本发明可以定性检测猪伪狂犬病。本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、适用于猪场现场的快速检测等特点。本发明的目的具体体现在以下几个方面：

1.常规PCR检测技术相比本技术速度慢，从采样到出结果最少需要48h，本技术仅需30-90分钟；

2.常规PCR需要需要PCR仪、电泳系统、凝胶成像系统等大型、昂贵的仪器设备本技术仅需要一个恒温箱或保温杯即可；

3.常规PCR的结果必须在凝胶成像仪下观察，本技术的试剂盒反应完毕后肉眼即可判定结果；

4.本试剂盒检测的敏感性、特异性比常规PCR更高。

其具体技术方案为：

一种猪伪狂犬病等温PCR现场快速检测试剂盒，

由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成，其序列为：

引物1：TCCGGATCTACCTCGACG

引物2：CCTCCTCGCTCAGGCT

内引物1：TCGGCTCGGGCACGTACAGCTACGGCACCGGCAAGA

内引物2：CGTACTGGCGCACTCTGTTCGGTTCTGCTTCCGGGTCTGC

其中，所述的一对引物与一对内引物的摩尔数之比为1：6～9；所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的阳性对照为含有插入猪伪狂犬病一段特异序列的阳性质粒，环介导等温扩增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为10⁷拷贝/μL；所述的阴性对照为灭菌双蒸水；所述的显色剂为20倍SYBR Green I。

优选地，所述的10倍环介导等温扩增反应液是由200mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、40～100mM硫酸镁、4～10M甜菜碱、5～18mM的dNTPs、和质量百分浓度0.1％的Triton X-100组成。

优选地，所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。

优选地，所述的阳性质粒的制作方法为：采用PCR扩增一段猪伪狂犬病TK基因特异序列，然后装入PMD18-T载体，转化至DH5α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至10⁷拷贝/μL。