[发明专利]一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于酶学、免疫学或生物学技术领域，尤其涉及一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

植物病毒病又被称为“植物癌症”，目前没有有效的治疗方法。对植物病毒病快速、准确的检测有助于病株的早期发现、隔离和销毁，也是植物抗病育种和脱毒苗的培育所必须的。诊断植物病毒的方法有传统生物学方法、电镜观察法、血清学方法和分子生物学方法等。

血清学方法是检测植物病毒最为常用和有效的手段之一。目前应用最广泛的血清学检测方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和斑点免疫结合测定法(DIBA)，DIBA法操作程序比ELISA法要简单，但其检测灵敏度低于ELISA法。

ELISA检测方法的基本原理是：以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。利用酶标抗体、抗原或次抗原作为一个检测体系，其灵敏度较高，可检测到纳克(ng)水平的病毒，并且可以减少检测时间，进行大规模样品调查，使常规病毒诊断变得非常容易，特别适合脱毒苗的检测。目前，应用最多的是双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)和间接ELISA(ID-ELISA)等方法。

DAS-ELISA检测法将已知抗体吸附于固相载体，加入待检样品(含相应抗原)与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体和底物，使抗体/抗原/酶标记抗体复合物与底物反应，呈现深浅不同的颜色反应。这种方法的优点：专业性强，灵敏度高、应用广泛，在国外已形成商业化生产。但是DAS-ELISA存在一定的缺点：(1)检测每种病毒都需要制备相应的酶标记特异性抗体，标记过程比较复杂，对技术和成本要求均高；(2)生产单克隆抗体存在杂交瘤细胞系的退化和某些杂交瘤细胞系在大鼠腹腔中不能诱生腹水的问题。

ID-ELISA检测法将待检样品(含相应抗原)吸附于固相载体，加入第一抗体(抗血清)与之结合，温育后洗涤，加入能识别第一抗体的酶标第二抗体和底物，使抗原/一抗/酶标二抗复合物与底物反应，呈现深浅不同的颜色反应。ID-ELISA的缺点：对病毒检测的特异性和灵敏度比DAS-ELISA的要低；优点：(1)无需针对每种待检病毒都制备相应的酶标记特异性抗体，降低成本和时间；(2)抗血清的制备方法容易，来源广泛。

目前，国内未见有辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)特异性抗血清制备、ELISA检测方法的建立和相应试剂盒制备的相关文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供上述PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒的制备方法，尤其是其中PMMoV特异性抗血清的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒在检测辣椒PMMoV的检测方面的应用，旨在解决辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的血清学检测尚属空白的问题。

本发明是这样实现的，一种PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒，包括：阳性对照、阴性对照、PMMoV特异性抗血清、酶标二抗、显色底物、封闭液、包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、抗体稀释缓冲液、底物缓冲液以及96孔酶标板；其中，PMMoV特异性抗血清的制备包括以下具体步骤：

(1)根据GenBank中公布的PMMoV各地分离物的CP序列设计一对RT-PCR引物：

正向引物：5'-CTACCCATGGCATACACAGTTACCAGTG，

反向引物：5'-GGAATTCAGGAGTTGTAGCCCACGTAA；

(2)对感染PMMoV贵州辣椒分离物的组织进行RT-PCR扩增、纯化以及回收，得到CP基因片段；

(3)将所述CP基因片段和原核表达载体pET32a(+)以Nco I和EcoR I两种DNA限制性内切酶进行双酶切处理、片段回收、连接、重组质粒转化大肠杆菌、重组CP蛋白表达以及重组CP蛋白回收；

(4)将所述重组CP蛋白作为抗原免疫家兔制备特异性PMMoV抗血清，免疫后取兔血，即得到PMMoV特异性抗血清。

优选地，所述阳性对照为含PMMoV病毒的辣椒叶片冷冻干燥后研磨成的细粉；所述阴性对照为健康无毒辣椒叶片冷冻干燥后研磨成的细粉；所述酶标二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体溶液。

本发明进一步提供了上述PMMoV贵州分离物ID-ELISA检测试剂盒在辣椒PMMoV的检测方面的应用。