[发明专利]一种血管瘤动物模型的建系方法

说明书

本发明涉及一种血管瘤动物模型的建系方法，包括：(1)血管内皮细胞特异表达的PyMT基因质粒的构建；(2)将上述构建好的质粒经PvuI酶切线性化，然后显微注射到小鼠受精卵中；(3)将出生的小鼠进行PCR鉴定，得到鉴定结果为阳性的转基因小鼠；所述的转基因小鼠出现血管瘤样表型；(4)将上述转基因小鼠作为培育转基因动物品系基础种群的首建鼠建立血管瘤动物模型。本发明中目的基因PyMT仅表达于血管内皮细胞中，避免了其在其他组织中诱导发生恶性肿瘤，模型动物表型专一，显示典型的血管瘤样改变；明显改善了PyMT基因的胚胎毒性，产生的阳性首建鼠的数量明显高于传统方法，可以稳定传代、建系，子代鼠也均有血管瘤表型。

技术领域

本发明属于心血管疾病的研究领域，特别涉及一种血管瘤动物模型的建系方法。

背景技术

良性先天性血管肿瘤是婴幼儿的常见疾病。新生儿的发病率为1～2％，1岁左右发病率上升至12％，而在体重低于1000g的早产儿中，发病率可高达23％。为了突破血管瘤研究瓶颈，更有效地认识血管瘤的发生、发展规律，建立一个理想的血管瘤动物模型是当务之急。

血管瘤的动物模型最早采用的是鸡冠模型，但是其组织发生和结构与血管瘤有着巨大差异，这一模型已被淘汰。目前，国内、外学者普遍接受的血管瘤动物模型的建立方法主要有2种：①通过接种血管瘤组织或内皮细胞，使动物产生与来源细胞生物学性状接近的血管瘤模型。虽然这种方法操作简便，成功率高，但是产生的动物模型仅模拟了血管瘤的局部疾病状态，无法在机体整体水平反映疾病发展过程中的系统生物网络变化规律，并且其产生的血管瘤与疾病的自然发生过程也存在较大的差异。②通过病毒感染、转基因技术将某些基因导入动物基因组，产生血管瘤表型。Williams最早采用多瘤病毒MiddleT(Polyomavirus Middle T,PyMT)基因建立了转基因血管瘤小鼠模型，诱发的动物模型在出生后2周左右出现血管瘤样表型，与自然发生的血管瘤极为相似。但是，采用PyMT转基因方法建立血管瘤小鼠模型存在2个明显缺陷：(1)PyMT转基因后不仅引起血管瘤的发生，也会诱发动物产生多种其他恶性肿瘤，导致模型的专一性差，降低其在血管瘤研究中的价值。(2)PyMT基因具有胚胎致死性，转基因阳性动物的出生率极低，且动物生殖力低下，造成难以获得足够数量的模型动物由于后续研究。这些问题的发生是因为PyMT基因在不同的组织中表达可以造成不同的病理变化，例如，在血管内皮中表达造成血管瘤表型，在乳腺组织中表达可以导致乳腺癌的发生，胚胎组织广泛表达PyMT基因造成严重的胚胎毒性，生殖细胞表达该基因造成小鼠生殖能力低下。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种血管瘤动物模型的建系方法，该方法制作的血管瘤动物模型的目的基因PyMT仅表达于血管内皮细胞中，避免了其在其他组织中诱导发生恶性肿瘤，模型动物表型专一，显示典型的血管瘤样改变。

本发明的一种血管瘤动物模型的建系方法，包括：

(1)血管内皮细胞特异表达的PyMT基因质粒的构建；

所述质粒中包含血管内皮细胞特异表达的启动子Tie2、真核生物转录所需Kozak序列、PyMT基因全序列、SV40 polyA信号和Tie2增强子序列；

(2)将上述构建好的质粒经PvuI酶切线性化，回收7.0kb的DNA片段；然后将上述DNA片段注射到受精卵的雄原核中，再移植到0.5天假孕鼠的输卵管中，得小鼠；

(3)将出生的小鼠进行PCR鉴定，得到鉴定结果为阳性的转基因小鼠；所述的转基因小鼠出现血管瘤样表型；

(4)将上述转基因小鼠作为培育转基因动物品系基础种群的首建鼠建立血管瘤动物模型。