[发明专利]一种血管瘤动物模型的建系方法

权利要求书

1.一种血管瘤动物模型的建系方法，包括：

(1)血管内皮细胞特异表达的PyMT基因质粒的构建；

所述质粒中包含血管内皮细胞特异表达的启动子Tie2、真核生物转录所需Kozak序列、PyMT基因全序列、SV40polyA信号和Tie2增强子序列；

(2)将上述构建好的质粒经PvuI酶切线性化，回收7.0kb的DNA片段；然后将上述DNA片段注射到受精卵的雄原核中，再移植到0.5天假孕鼠的输卵管中，得小鼠；

(3)将出生的小鼠进行PCR鉴定；

(4)将步骤(3)鉴定后的转基因小鼠作为培育转基因动物品系基础种群的首建鼠建立血管瘤动物模型。

2.根据权利要求1所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：步骤(1)中所述的血管内皮细胞特异表达的PyMT基因质粒构建的具体操作方法为：

以鼠尾DNA为模板，分别PCR扩增Tie2启动子，Tie2增强子，以pPymt为模板PCR扩增PyMT基因全长；PCR体系为：模板DNA：1μl，5xPCR缓冲液：4μl，三磷酸脱氧核糖核苷：1μl，PCR引物混合物：2μl，PCR聚合酶：0.2μl，双蒸水：11.8μl；反应程序为：95℃3分钟，98℃15秒，55℃-68℃15秒，72℃90秒，72℃5分钟，35个循环；用KpnI和SalI酶切Tie2启动子序列，XhoI和NheI酶切PyMT基因序列，XbaI和ClaI酶切载体连接片段序列，ClaI和SalI酶切Tie2增强子，依次连接到pGL3-Basic载体上；

上述构建用引物如下：

Tie2启动子上游引物catggtaccgcggaagcttactaagatctaatgaaaatc；

Tie2启动子下游引物catgtcgacTTCAACAACTCACAACTTTGCG；

Pymt上游引物catctcgagagcctcaccaccatcATGGATAGAGTTCTGAGCAGAG；

Pymt下游引物catgctagcCTAGAAATGCCGGGAACG；

载体连接片段上游引物GTGTAATTCTAGAGTCGGGGC；

载体连接片段下游引物CGACGGATCCTTATCGATTTTACC；

Tie2增强子上游引物catatcgatctcgaggtccagtatggcttc；

Tie2增强子下游引物catgtcgacgtaccattattgttttacttgggagg。

3.根据权利要求2所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：所述鼠尾DNA的制备如下：取出生10天的C57BL/6J小鼠鼠尾0.3cm，加450μl裂解液及10mg/ml的50μl蛋白酶K，56℃消化过夜；离心取上清液，无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，稍晾干后 溶解于200μl纯水中，即可。