[发明专利]桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种RNA干扰载体，尤其涉及一种桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体及其构建方法和应用。

背景技术

桔小实蝇Bactroceradorsalis又名东方果实蝇，是一种世界危险性检疫害虫，广泛分布于中国各大柑橘产区，使中国的柑橘产业面临着严重威胁，每年都对柑橘为害造成巨大经济损失，能危害250多种瓜果蔬菜。桔小实蝇寄主范围广，可危害柑橘、芒果和杨桃等250多种水果蔬菜和作物。随着气候变化、种植结构的调整和国际贸易的增加，其危害面积逐渐扩大，给果蔬业带来严重的经济损失。目前化学防治仍是控制桔小实蝇的重要措施，然而近年来对桔小实蝇种群抗药性监测表明，其抗药性上升非常快。

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默现象，它是指通过双链RNA的介导的特异性的降解对应序列的mRNA，从而特异性地抑制相应基因的表达，是植物对外来入侵者的一种重要的防御机制。基于RNA干扰技术获得抗昆虫的转基因材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上取得成功。细胞色素P450s是一种具有血色素类似结构的多功能氧化酶系，该酶系由数 量众多、功能多样的不同成员构成，形成了一个超家族。一些P450基因通过对内源激素的合成或降解，参与昆虫的生长、发育和生殖等重要的生理代谢过程。目前还没有人将桔小实蝇细胞色素P450基因用于构建RNA干扰载体对桔小实蝇进行控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体，该载体含有桔小实蝇细胞色素P450基因目的片段，得到的转基因植株可以使取食该植株的桔小实蝇发生RNA沉默现象，使得转基因植株对桔小实蝇具有一定抗性。

本发明还提供干扰细胞色素P450基因表达载体的构建方法和应用，为利用RNA干扰技术的植物抗虫育种工程提供了一种新的策略和思路。

桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体，包括骨架载体和正、反义链，其特征在于：以桔小实蝇细胞色素P450基因部分片段为正或反义链，所述细胞色素P450基因部分片段序列如SEQIDNO.1，所述骨架载体为PFGC5941载体。

所述正义链插入在酶切位点XhoI和NcoI之间，反义链插入在酶切位点XbalI和BamHI之间。

桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体的构建方法，包括如下步骤：

1)细胞色素P450基因目的片段与质粒的连接

提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，以SEQIDNO.2和SEQIDNO.3为引物对细胞色素P450基因的正向目的片段进行PCR扩增，以SEQIDNO.4和SEQIDNO.5为引物对细胞色素P450基因的反向目的片段进行 PCR扩增，得到PCR产物，目的片段约为600bp，回收PCR产物，与载体pMD-19连接，转化大肠杆菌DH5α得到重组质粒pMD-19-P1F1和pMD-19-P2F2，进行序列验证，测序正确的目的片段即可用于RNA干扰载体的构建；所述SEQID NO.2～5的序列如下：

SEQIDNO.2：5’-GCCATGGATAGTCTGAACGAACCGAA-3’；

SEQIDNO.3：5’-CCATGGGATAGATTTCGGGATCAC-3’；

SEQIDNO.4：5’-GCTCTAGAGCATAGTCTGAACGAACCGAA-3’；

SEQIDNO.5：5’-CGGGATCCGATAGATTTCGGGATCAC-3’；

2)细胞色素P450基因的RNA干扰载体的构建

将上述测序正确的细胞色素P450基因正向目的片段质粒pMD-19-P1F1与载体PFGC5941分别用XhoI和NcoI双酶切，将pMD-19-P1F1与载体PFGC5941的酶切产物进行连接得到插入正向目的片段的重组质粒PFGC5941-P1F1；将PFGC5941-P1F1和细胞色素P450基因反向目的片段质粒pMD-19-P2F2分别用XbalI和BamHI双酶切，将酶切产物进行连接，即可得到插入正、反义链的RNA干扰载体PFGC5941-P1F1/P2F2，经PCR扩增检测、核苷酸序列分析，目的片段序列正确的干扰载体可用于农杆菌转化。

所述的桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体在转基因植物中的应用，所述转基因植物为柑橘属植物。