[发明专利]一种催化生产1;5-戊二胺的工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种催化生产1,5‑戊二胺的工程菌及其应用。本发明公开的一种工程菌，是在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因cadB。本发明公开的工程菌是在大肠杆菌B系列衍生菌株中过量表达赖氨酸脱羧酶基因cadA并同时适量表达赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因cadB构建的1,5‑戊二胺全细胞催化工程菌；本发明进一步公开了利用该工程菌催化生产1,5‑戊二胺的方法，该方法可以实现高转化率、高生产强度和高产量地催化产生1,5‑戊二胺，降低了1,5‑戊二胺的生产成本，从而在实践上可用于1,5‑戊二胺大规模生产，便于推广应用。

技术领域

本发明涉及一种催化生产1,5-戊二胺的工程菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

1,5-戊二胺(1,5-Pentanediamine)，又名尸胺(Cadaverine)、1,5-二氨基戊烷(1,5-Diaminopentane)，与二元酸聚合可合成高分子聚酰胺材料(即尼龙)。全球每年生产约700万吨聚酰胺材料，消耗了大量石化资源，因此生物法合成聚酰胺的重要组成单体—1,5-戊二胺，具有重要的经济学和生态学意义。生物法生产1,5-戊二胺主要采用微生物发酵和催化两种方法。目前，赖氨酸作为大宗氨基酸品种之一，其产能严重过剩，导致利润率下降。因此，开发高效的以赖氨酸为底物的戊二胺生物催化的生产方法，可以推进氨基酸发酵产业的转型升级。

大肠杆菌是最常用的全细胞催化生产戊二胺的微生物。大肠杆菌中的1,5-戊二胺操纵子依次包括诱导型启动子Pcad、赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB和赖氨酸脱羧酶基因cadA。在低pH值、高赖氨酸浓度条件下，1,5-戊二胺操纵子上游调节基因cadC被激活，其产物作用于Pcad启动子，激活赖氨酸脱羧酶CadA和赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白CadB的表达合成。CadA催化细胞内的赖氨酸合成1,5-戊二胺，CadB将合成的1,5-戊二胺转运至细胞外(J Bacteriol,1992,174(8):2659–2669.)。除了诱导型赖氨酸脱羧酶CadA外，大肠杆菌还包含组成型赖氨酸脱羧酶LdcC。

在全细胞催化生产1,5-戊二胺的现有技术中，专利(US7189543、EP1482055)以pUC18为载体过表达赖氨酸脱羧酶基因cadA，并将该重组质粒转化至大肠杆菌K12衍生系列菌株JM109中，获得全细胞催化生产1,5-戊二胺的工程菌的戊二胺催化产量和戊二胺催化速率较低。为了提升工程菌的催化性能，需要采用热处理、冷冻熔融以及超声等细胞处理工艺(专利CN102782146)，但是该处理工艺增加了实际生产工艺难度和生产成本。此外，上述1,5-戊二胺生物催化工艺需要在工程菌培养结束后收集菌体，去除培养液以后再加入催化液和底物赖氨酸进行戊二胺催化过程，增加了生产工序、操作时间、生产成本和废水排放。总之，目前戊二胺生物催化的现有技术存在工程菌细胞催化性能低、催化工艺复杂、成本高等问题，严重限制了1,5-戊二胺生物催化的实际工业化生产应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种催化生产1,5-戊二胺的工程菌及其应用。

本发明提供一种工程菌，是在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB。

上述工程菌中，所述过表达赖氨酸脱羧酶基因的方法是将所述赖氨酸脱羧酶基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表达质粒中的启动子之后进行表达；

所述适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB是指将包含或不包含RBS序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表达质粒中的赖氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列之后进行表达；或，使用适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子替换大肠杆菌B株或其衍生菌株染色体上的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因自身的启动子；

所述适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子具体为L启动子、trc启动子、T5启动子、lac启动子、tac启动子或T7启动子。