[发明专利]一种利用木糖产聚羟基烷酸酯菌群的筛选和驯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效利用木糖产聚羟基烷酸酯菌群的筛选和驯化方法。

背景技术

聚羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoates PHA)是许多细菌在生长不平衡条件下合成的碳源储藏性颗粒，作为一种可再生、可生物降解塑料受到人们青睐。它除具有与传统塑料相近的性质，还兼有生物相容、光学活性等特性，成为塑料的良好替代品，在解决环境污染和能源紧张方面具有很大的潜力。目前，PHA主要采用纯菌发酵生产，包括产碱杆菌、固氮菌、假单胞菌以及重组大肠杆菌等。但纯菌发酵需使用葡萄糖等优质底物，以及灭菌等发酵控制工艺造成PHA生产成本昂贵，高于传统塑料的5-10倍[1]。高昂的价格严重阻碍了PHA的市场需求和使用。

纤维素生物质材料作为地球上最为丰富的可再生资源，广泛存在于秸秆等各种农林产品及其加工废弃物中，但纤维素生物质结构致密，很难被生物利用，导致这些可再生资源并没有得到大规模的回收再利用。木质纤维素原料中，木糖的含量达18％～30％，是自然界中第二大的糖类物质[2]。因此许多学者通过人工筛选或构建获得利用木糖产PHA菌株，以期利用木糖产PHA，为以纤维素为原料产PHA奠定基础，从而大幅降低PHA的生产成本。但是目前单菌利用木糖产PJHAs的能力仍十分有限，最大产量仅达到3g/l左右[3,4]，远远无法满足工业生产的要求。

微生物普遍以多细胞体系存在于自然界，99％的微生物不可纯培养。利用广泛分布于自然界的微生物多细胞体系为人类生产生活服务，是一种低成本、高效益的经济模式，同时相对于单菌，混菌的稳定性高，鲁棒性好，能耐受多变的环境完成更加复杂的生物功能[5]，因此已经在医药、食品酿造、环境保护、能源资源等领域得到广泛应用。同时混菌发酵使用开放系统，无需灭菌等操作成本，所以混合菌群利用木糖产PHA可以显著降低PHA的成本。但是，对PHA合成菌株缺乏合适的驯化筛选压力，传统的饱食饥饿模式和厌氧好养模式驯化周期长，并且需要以小分子脂肪酸类物质为驯化底物，因此目前尚无混合菌群利用木糖产PHA的报道。

[1]K Sudesh,K Bhubalan,JA Chuah,et al.Synthesis of polyhydroxyalkanoate from palm oil and some new applications.App Microbiol and Biot,2010,89:1373-1386

[2]徐勇,王荥,朱均均,勇强,余世袁.木糖高效生物转化的新出路[J].中国生物工程杂志(China Biotechnology),2012,32(005):113-119

[3]FK Young,JR Kastner,SW May.Microbial Production of poly-β-hydroxybutyric acid from d-xylose and lactose by Pseudomonas cepacia.Appl Environ Microb,1994,60:4195-4198

[4]R Li,Q Chen,PG Wang,et al.A novel-designed Escherichia coli for the production of various polyhydroxyalkanoates from inexpensive substrate mixture.Appl Microbiol Biot,2007,75:1103-1109

[5]K Brenner,L You,FH Arnold.Engineering microbial consortia:a new frontier in synthetic biology.Trends Biotechnol,2008,26:483-489

发明内容

鉴于上述，本发明提供了一种高效利用木糖产PHA菌群的筛选和驯化方法——使用饱食饥饿模式驯化结合尼罗蓝染色筛选的方法对菌群施加明确的筛选压力。

本发明的技术方案如下：

以富含混合菌群的活性污泥为原料，利用混合菌群产PHA的饱食饥饿驯化模式进行驯化，驯化过程中取样，使用尼罗蓝染色法进行PHA合成菌群的筛选；筛选得到的PHA高产菌群富集培养后回注到正在驯化中的体系中，对驯化中的菌群进行扰动；驯化结束后使用得到的混菌体系进行PHA发酵生产，发酵结束后进行PHA提取。

所述的饱食饥饿驯化模式是包括进料、通气，沉降和排水四个步骤为一个培养周期。