[发明专利]利用海洋真菌生产免疫抑制化合物的方法及其培养基

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学领域，具体涉及用于生产免疫抑制化合物的培养基技术领域，更具体地，涉及利用海洋印尼红藻共生真菌Daldinia eschscholzii生产免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B的方法及其所用培养基。

背景技术

海洋微生物是生物功能天然产物的重要来源之一，从海洋中寻找天然活性物质正在成为新药开发的研究热点。海洋生物生活在高压、低营养、低温(特别是深海)、无光照以及局部的高温和高盐等环境中，造成了海洋微生物的多样性和特殊性。海洋微生物由于适应了海洋环境，有了新的特异性，能产生陆栖微生物所不能产生的结构新颖、作用特殊的活性物质，这些活性物质将极大地克服机体的抗药性，同时为新药研发提供新的先导化合物，可以作为重要的海洋药物资源。

南京大学谭仁祥教授从海洋印尼红藻（Gracilaria sp. SGR-1）分离得到了海洋印尼红藻共生真菌Daldinia eschscholzii，其属于光轮层炭壳菌。该菌经过液体或固体发酵可产生多种代谢物质。Dalesconol A（简称DA）和Dalesconol B（简称DB）是其产生的一种聚酮类次级代谢物，其体外的T细胞增殖实验表明DA和DB具有显著的免疫抑制效应（IC₅₀: 0.16～0.58μg/mL），同目前临床上使用最多的环孢素A相近（IC₅₀: 0.06μg/mL），而且相较于环孢素A，DA和DB具有选择性更广、副作用更小的优点，是一种具有良好前景的免疫抑制候选药物。

然而，化合物DA和DB在初始环境下的产率相当低，已成为制约DA和DB用于临床前研究的瓶颈。因此需要通过优化其培养环境来使得化合物DA 和DB获得稳定的高产。但微生物发酵是一个极其复杂的生物过程，涉及到许多相互影响的因素，产物生物合成水平受到很多方面的影响，其中适宜的培养基是微生物发酵的一个关键性因素。因此，针对该菌种的培养基进行优化显得十分重要。

目前比较成熟的优化培养基的方法有单因素实验、Plackett-Burman (筛选试验设计，简称PB)设计、正交实验、响应面设计等。

其中，Plackett-Burman 设计，可对多个不同因子对响应值的显著性进行分析，从而找出对发酵产量或细胞生长最为重要的培养基组分，该方法分别对每个因子取高（+1）和低（-1 ）两个水平，通过每个因子两水平之间的差异与整体差异之间的统计分析来确定各因子对相应变量的显著性。该方法可大大提高筛选效率，能以最少的试验次数使因素的主效果得到尽可能精确的估计。

响应面设计方法由Box-Wilson 方法发展而来的，它是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过响应面和等高线分析，能够精确地研究各因子与响应变量之间的关系，优化出最佳工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。响应面法是一种适用性强的实验设计方法，包括实验设计、建模及寻求因子水平最佳操作条件等功能，显示出了其他方法所不具备的优点。该方法不但具备试验次数少，周期短、精度高等优点，而且可以对各因子水平及其交互作用进行优化和评价，可快速有效的确定多因子系统的最佳条件。

因此，通过联用PB设计和响应面设计，可以通过摇瓶实验确定重要因素，再针对重要因素得到最佳的组分水平，从而可大大加快获得最佳的培养基组成。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，解决限制对免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B深入研究的瓶颈问题，提供一种用于发酵海洋印尼红藻共生真菌Daldinia eschscholzii生产免疫抑制剂Dalesconol A和Dalesconol B的培养基及其制备方法，及使用该培养基发酵生产Dalesconol A和Dalesconol B的方法。该培养基成分简单，制备方法操作方便，成本低廉，不需特殊设备，而使用该培养基发酵海洋印尼红藻共生真菌Daldinia eschscholzii生产免疫抑制剂Dalesconol A和Dalesconol B，能显著提高Dalesconol A和Dalesconol B的产量。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：